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Jun 30, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13880 (2023) Citar este artículo

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En el estudio, se desarrolló una plataforma biomimética para el tratamiento antiinflamatorio de la placa aterosclerótica. La gliclazida (GL) como agente antiinflamasoma se encapsuló en nanopartículas de PLGA (NP), que se recubrieron con una membrana de monocitos mediante un procedimiento de extrusión. El tamaño y el potencial zeta del nanoghost (NG) cambiaron a 292 y – 10 nm de 189,5 a −34,1 en el NP central. Además, se midió mediante TEM el tamaño real de 62,5 nm con una capa de recubrimiento de 5 nm. El NG también mostró un perfil de liberación sostenida con un contenido de carga de fármaco de aproximadamente el 4,7%. Además del TNFα atenuado, la disminución en los niveles de expresión génica de NLRP3, MyD88, NOS, IL-1β, IL-18 y caspasas 1/3/8/9 en monocitos preparados con LPS expuestos a NG indicó fuertemente un notable control de la inflamación. Después de la evaluación de la toxicidad sistémica y el análisis farmacocinético de NP y NG, el tratamiento con NG intravenoso de conejos con aterosclerosis inducida experimentalmente reveló notablemente menos lesiones de placa, células espumosas, macrófagos cargados de lípidos y problemas patológicos en la túnica media de las secciones de la aorta. Una mayor expresión de CD163 que de CD68 en la aorta de conejos tratados con NG revela claramente una mayor polarización de macrófagos M2/M1. El NG bio/hemocompatible, biomimético y antiinflamatorio puede considerarse como una plataforma potencial para la inmunoterapia, en particular de la aterosclerosis, en el campo de la medicina personalizada.

Hoy en día, el tratamiento de enfermedades inflamatorias basado en nanopartículas presenta desafíos críticos que han atraído la atención de los científicos. Entre el grupo de enfermedades relacionadas con la inflamación, la aterosclerosis es una lesión vascular arterial común que provoca complicaciones cardiovasculares y, en ocasiones, la muerte. Se ha informado que la deposición de grasa en las arterias y la formación de placas causan aterosclerosis y la progresión de la placa conduce a la fibrosis de la pared del vaso. Algunas evidencias muestran que la ruptura mediada por la inestabilidad de la placa produce trombosis venosa y consecuencias peligrosas como el síndrome coronario agudo (SCA) y el accidente cerebrovascular1.

La inflamación ocurre en las primeras etapas de la aterosclerosis, donde las células inmunes migran al sitio de depósito de lípidos en las arterias. Es obvio que los macrófagos juegan un papel muy importante en el desarrollo de la lesión de la placa inicial en la que los monocitos se diferencian en macrófagos y captan la forma oxidada de lipoproteínas de baja densidad (ox-LDL) para formar células espumosas2,3,4,5.

Otras lesiones de placa en las arterias están relacionadas con la secreción de citoquinas proinflamatorias y la infiltración de células inmunes en la acumulación de placa5.

Se ha demostrado que NLRP3, un componente predominante del inflamasoma, está implicado en el desarrollo de la aterosclerosis. De hecho, el inflamasoma consta de oligómeros, sensor NLRP3, caspasa-1 y adaptador ASC. La activación del complejo inflamasoma convierte la pro-caspasa 1 en caspasa 1, convirtiendo la pro-IL1 en IL1, desencadenando así una inflamación aguda6,7,8.

De hecho, la activación del inflamasoma se conoce como una forma inflamatoria de muerte celular programada, llamada piroptosis, donde los macrófagos y las células dendríticas desempeñan un papel importante en lugar de los neutrófilos1,9,10,11,12.

Aunque los medicamentos antiinflamatorios no son clínicamente habituales para tratar pacientes con trastorno aterosclerótico, se sugiere la modulación de la respuesta inflamatoria mediante agentes antiinflamasomas como una estrategia alternativa para el tratamiento de la aterosclerosis. Los derivados de sulfonilurea, como la gliclazida (GL), se han utilizado para controlar las enfermedades diabéticas. Recientemente, los efectos antiinflamatorios del GL han sido reportados en la literatura13, atribuyendo los posibles efectos a propiedades antioxidantes del GL y inhibidoras de NLRP314.

Hoy en día, el tratamiento eficaz de la aterosclerosis se ha facilitado mediante la nanomedicina, aplicando nanomateriales para lograr resultados clínicos15. Las nanopartículas (NP) se utilizan como portadores de fármacos para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades debido a sus propiedades especiales, incluido el tamaño deseado, la forma ajustable, la alta solubilidad, la buena estabilidad y la capacidad de penetración16.

En esta área, nuevas estrategias biomiméticas han motivado a los científicos a fabricar vehículos a nanoescala bioinspirados con una vida media aumentada y una respuesta inmune disminuida mediante la funcionalización de la superficie. En comparación con los portadores de fármacos de células vivas, se mencionan ventajas importantes para los métodos de membrana celular, llamados nanoghost (NG) y, en este caso, nanoghosts basados ​​en monocitos. Las nanopartículas recubiertas por la membrana celular no sólo escapan del sistema inmunológico sino que también se recubren como células autógenas. Además, la NG se conducirá al tejido objetivo utilizando ligandos localizados en su superficie17.

Recientemente, se ha informado que los monocitos son una plataforma adecuada para administrar terapias en el sitio de las células endoteliales dañadas en la aterosclerosis, porque las células endoteliales activadas unen a los monocitos mediante moléculas de adhesión18. Aprovechando las ventajas de las propiedades biomiméticas de la membrana de monocitos, diseñamos nanopartículas de PLGA recubiertas con membrana de monocitos mediante un procedimiento de extrusión después de cargarlas con GL para el tratamiento de la aterosclerosis. El nanovehículo biomímico se caracterizó fisicoquímicamente y se evaluó su hemocompatibilidad. Se evaluó la capacidad del NG diseñado para prevenir la inflamación en el modelo in vitro e in vivo de aterosclerosis en particular (Fig. 1).

Una plataforma biomimética guiada por macrófagos diseñada aquí contra la aterosclerosis. Una plataforma biomimética guiada por macrófagos con un agente antiinflamatorio, gliclazida (GL), encapsulada en nanopartículas de PLGA y recubierta en general con una membrana de monocitos con una técnica de extrusión para generar nanofantasmas farmacéuticamente aplicables para protegerse de la aterosclerosis.

GL fue amablemente proporcionado por Abidi Pharma Co (Teherán, Irán). PLGA (Mw.38000-4000, 50:50) se compró a Sigma Company (Dubai, Emiratos Árabes Unidos). Todos los reactivos y disolventes se adquirieron en Merck Company (Dubai, Emiratos Árabes Unidos). El inhibidor de la fosfatasa contó con el apoyo de Kiazist Company (Hamedan, Irán).

Las nanopartículas se prepararon mediante un método de emulsión única y evaporación de disolvente según un procedimiento modificado9. Brevemente, se disolvieron PLGA y GL en 2 ml de diclorometano (DCM) y luego se agregaron gota a gota a 20 ml de fase acuosa de PVA al 1% seguido de sonicación con sonda (MISONIX) a 60 amplitudes durante 5 minutos en un baño de hielo. Para evaporar la fase orgánica, la nanoemulsión se agitó magnéticamente durante 4 h a temperatura ambiente. Finalmente, la emulsión se centrifugó durante 15 min a 9000 rpm para precipitar las nanopartículas.

En consecuencia19, se cultivaron monocitos puros aislados en medio RPMI-1640 con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Esto se hizo para volver a comprobar si la calidad de los NG con monocitos puros humanos frente a las líneas de monocitos U937 difiere o es idéntica. Luego se incubaron los monocitos U937 (Banco Nacional de Células de Irán, Instituto Pasteur, Teherán) a 37 °C en presencia de 5% de CO2 hasta un 80% de confluencia.

Los monocitos U937 aislados en el paso anterior se centrifugaron a 8000 rpm durante 15 minutos y luego se lavaron 2 a 3 veces con PBS. Posteriormente, se agregaron tampón de lisis (PBS, tampón TM y sacarosa 0,25 M) y reactivo inhibidor de fosfatasa a las células en hielo durante 20 minutos. El lisado celular se precipitó durante 35 min a 100.000 rpm con ultracentrifugación. Se descartó el sobrenadante y los sedimentos se lavaron con PBS. Se agregaron tampón TM y sacarosa 0,25 M y se almacenaron a 4 °C.

Primero se homogeneizó el extracto de membrana celular de monocitos U937, seguido de una extrusión secuencial de 5 veces a través de una membrana de policarbonato con tamaños de poro de 400 y 200 nm. Luego, las membranas se mezclaron con PLGA NP cargado con GL y se extruyeron a través de una membrana de policarbonato de 200 nm 5 veces.

El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las nanopartículas y el NG se determinaron mediante zetaziser (Malvern, Nano ZS90). Además, la morfología del NG obtenido se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Para verificar la lateralidad de la membrana de monocitos para el recubrimiento de nanopartículas de PLGA, se evaluó el contenido de ácido siálico como un indicador de la lateralidad, porque la distribución del ácido siálico es asimétrica y hay más abundancia fuera de la membrana. A este respecto, se añadieron por separado 100 unidades de sialidasa (Sigma-Aldrich) a la porción equivalente de membrana de monocitos como control positivo y a la de PLGA NP como control negativo en paralelo con el NG. Después de una incubación durante 3 h, la mezcla se centrifugó a 100.000 xg durante 1,5 h. Finalmente se separó el sobrenadante para la determinación colorimétrica de grupos sialilos a 549 nm.

Se disolvieron aproximadamente 5 mg de GL en 10 ml de DCM para preparar una solución madre estándar. Luego se diluyó la solución para obtener soluciones estándar de 15,62, 14,29, 12,82 y 12,5 mg/ml. Para preparar una solución de muestra, se disolvió NG liofilizado en los mismos disolventes y se agitó vigorosamente durante una hora. La solución, que pasó a través del filtro de membrana, se midió junto con las soluciones estándar utilizando un espectrofotómetro UV-Vis (JASCO-UV1500) a 243 nm (consulte la Tabla 3 complementaria y la Fig. 2 complementaria).

La NG se disolvió en 1 ml de tampón PBS y se transfirió a una bolsa de diálisis en un tubo Falcon que contenía 25 ml de medio tampón PBS a 37 °C, agitando a 100 rpm. Se tomaron 500 ml de muestra del medio en diferentes intervalos de tiempo y se reemplazó por PBS del mismo volumen. El porcentaje de liberación de fármaco se determinó de manera similar al procedimiento de estimación de carga.

Se proporcionó sangre entera fresca de un laboratorio de diagnóstico (Pooyesh, Karaj) en un tubo que contenía citrato. La muestra de sangre se centrifugó a 2000 rpm para eliminar el plasma y los desechos. A continuación, el sedimento de eritrocitos final se diluyó 3 veces. Se agregaron 200 ml de diferentes concentraciones de suspensión de NG a los 800 ml de suspensión de PBS diluida. Las soluciones tampón PBS y Triton X100 se consideraron controles positivos y negativos, respectivamente. Luego, las soluciones mezcladas se mezclaron suavemente mediante inversión y se transfirieron a un baño de agua, agitando a 100ºC durante 1 h a 37 °C. Posteriormente, todas las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm durante 1 min y los valores de absorbancia de los sobrenadantes se midieron a 541 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis20,21.

Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 como se describe anteriormente. Después de 24 h, se agregaron 50 ng de LPS a cada pocillo y se incubaron durante 2 h para inducir un microambiente inflamatorio para las células. Posteriormente, las células se trataron con NG y NP (que contenían aproximadamente 50 ng/ml de GL) y se dejaron durante 24 h. Finalmente, las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 rpm para análisis por RT-PCR.

El ARN total de monocitos tratados con NG (no) se extrajo utilizando un kit de extracción de ARN (Yekta Tajhiz Azma (YTA) Co., Irán Cat No. YT2551). Después de analizar la electroforesis en nanogota y gel de agarosa, el ARN se convirtió en ADNc. De hecho, para la síntesis de ADNc, se transcribieron de forma inversa 1000 ng de ARN total en ADNc en un volumen de reacción de 20 µl utilizando el kit de síntesis de ADNc (YTA, número de catálogo: YT4500, Irán). Los niveles de expresión de algunos genes inflamatorios y relacionados con la apoptosis para diferentes grupos se evaluaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), utilizando específicamente cebadores secuenciados por unión de dos exones en consecuencia19,22,23. Se verificó la posición y las bandas adicionales de todos los cebadores utilizando Beacon Designer v8, Oligo y NCBI, Primer-BLAST. Luego, después de ordenar y comprar los cebadores, estos fueron diluidos y utilizados según el protocolo del fabricante. Las secuencias de los cebadores se demostraron en la Tabla 2 complementaria.

Las condiciones de qPCR para todos los genes se llevaron a cabo (por triplicado) con un programa de ciclado que incluía mantener durante 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, recocido a 61 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s junto con una extensión final de 72 °C durante 10 min. También se realizaron análisis de la curva de fusión y electroforesis en gel de agarosa para determinar la especificidad de las reacciones o la ausencia de productos de PCR no específicos. Al utilizar el software GenEx 624, los datos se analizaron de acuerdo con el método comparativo de Ct (2−ΔΔCt) como cambio en relación con el nivel de expresión de las muestras de control19,22,23.

Después de la inducción con LPS y el tratamiento con NG/NP como se mencionó anteriormente, se transfirieron 50 µl de sobrenadantes en paralelo a los estándares a pocillos en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 60 minutos con agitación a 200 rpm a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con solución de lavado y se agregaron 50 µl de anticuerpo conjugado y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos en un agitador a 200 rpm. Después del lavado, se agregaron 50 µl de solución de HRP-avidina a todos los pocillos y se incubaron durante 30 minutos en las mismas condiciones, seguido de un lavado 5 veces. Finalmente, se agregaron 50 µL de sustrato a los pocillos y se incubaron durante 15 minutos antes de agregar la solución de parada (25 µL). La absorbancia de las muestras y los estándares se midió a 450 nm utilizando un lector de placas para calcular los niveles de TNF-α. La sensibilidad del kit para TNF-α fue < 1 pg/ml.

A quince conejos blancos machos sanos de Nueva Zelanda (Instituto Razi) con un peso promedio de 8200 ± 50 gr en 3 grupos (tratados con PBS, NP y NG) se les inyectaron por separado 100 µL de NP y NG (que contenían 6 µg de GL), así como PBS. El tratamiento se siguió todos los días para los grupos tratados hasta un mes. Los animales fueron pesados ​​cada semana para evaluar la toxicidad sistemática de los tratamientos.

Se introdujeron al estudio farmacocinético animales con las mismas características en el estudio de toxicidad sistémica. Después de la inyección intravenosa de PLGA NP y NG cargados con GL (100 μL que contienen 2,88 μL de GL) en cada animal, se tomaron muestras de sangre a intervalos de tiempo predeterminados (0, 0,5, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48). h). El contenido de GL se determinó mediante HPLC. Las muestras se centrifugaron a 12000 rpm durante 8 minutos para separar el plasma. Se agregaron 20 μL de plasma a 40 μL de acetonitrilo y se mezclaron, se centrifugaron a 11.000 rpm durante 4 min para separar el sobrenadante. El sobrenadante se evaporó y su residuo se disolvió en la fase móvil para su determinación por HPLC en las mismas condiciones descritas. Las concentraciones de GL se estimaron frente a la curva de calibración estándar.

La vida media (t1/2) y los parámetros farmacocinéticos del estudio se calcularon estadísticamente mediante el software Excel (versión 2016).

Se compraron treinta y dos animales del Instituto de Investigación de Sueros y Vacunas Razi (Karaj, Irán). Los principios éticos del cuidado y los derechos de los animales fueron observados y aprobados por el comité de ética en investigación de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Teherán (IR.UT.VETMED.REC.1401.006), así como por los autores. Después de un período de adaptación de una semana, los grupos NG, NP y positivo fueron alimentados con 200 g de dieta comercial por día, suplementada con colesterol al 2% (p/p) durante 8 semanas para inducir la placa de aterosclerosis. Por el contrario, el grupo de control fue alimentado con comida normal. Los animales se dividieron en cuatro grupos experimentales: grupo NG: los conejos alimentados enriquecidos con colesterol recibieron inyecciones intravenosas de NG; Grupo NP: conejos alimentados enriquecidos con colesterol tratados con inyecciones intravenosas con nanopartículas cargadas con fármaco simple; grupo normal/control: los animales fueron alimentados con alimentos sanos/normales sin administración de fármacos; Grupo de control positivo: los animales fueron alimentados con una dieta enriquecida en colesterol sin tratamiento.

Después de 8 semanas, comenzó la administración intravenosa de nanofármacos y continuó durante las siguientes 4 semanas; por lo tanto, el día 28 fue el punto final del estudio). Desafortunadamente, entre 45 conejos, 13 murieron debido principalmente a complicaciones de aterosclerosis en el proceso de inducción.

La administración fue diaria para los grupos tratados con NP y PBS, mientras que se realizó cada 2 días para el grupo tratado con NG (que contenía aproximadamente 50 ng/ml) hasta un mes.

Finalmente, se inyectó por vía intramuscular la mezcla de 35 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina a conejos anestesiados. Posteriormente, los animales fueron sacrificados para separar la aorta, el riñón y el hígado25. Además, se controlaron los análisis bioquímicos de colesterol (Ch), triglicéridos (TG), azúcar en sangre (BS), alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferencia (AST) utilizando kits de diagnóstico (Pars Azmoon, Irán) en el laboratorio Pooyesh. Karaj, Irán (información de respaldo).

Las secciones se tiñeron en el laboratorio especializado en patología veterinaria Arnapat (Teherán, Irán) para experimentos macroscópicos y microscópicos adicionales según un procedimiento26, con una modificación menor. Brevemente, el tejido congelado se cortó en secciones de aproximadamente 12 µm en un criostato a partir de la biopsia. Los portaobjetos con sección se sumergieron en hematoxilina de Harris filtrada durante 10 s y tinción con EOSIN durante ~ 30 s, lavando secuencialmente con agua después de cada tinción. Luego las muestras se deshidrataron en concentraciones ascendentes de soluciones alcohólicas. Finalmente, se montó un cubreobjetos sobre las secciones en un portaobjetos de vidrio con un soporte.

Las secciones generalmente se tiñeron para antígenos panmacrófagos, CD68 (clon: KP1, fuente: Isotipo de ratón: IgG1, kappa), CD14 (clon: MD85R, fuente: Conejo, Isotipo: IgG) y CD163 (fuente: Conejo, Isotipo: IgG ) según las instrucciones, respectivamente (Diagnostic Biosystems, zytomed Systems, Medaysis)27. Además, los datos se presentaron en comparación con anticuerpos no inmunes (isotipo: IgG, fuente: conejo, control no inmunológico) según las instrucciones (empresa MyBioSource). Se contó el número de macrófagos positivos para evaluar la tinción de CD68+ y CD163+ mediante un método de estimación semicuantitativa28.

El área de lesión de las placas se cuantificó mediante OPTIKA PROView (Versión X64), que es un software de análisis de imágenes profesional. La superficie total de la placa en el grupo NG se estimó en comparación con el grupo positivo.

Los datos se expresaron en unidades SI y se analizaron mediante mediciones repetidas ANOVA, Duncan, Spearman y prueba T utilizando el software SPSS (versión 12.0.4). Los análisis histoquímicos e inmunohistoquímicos se realizaron mediante el software Graphpad prism (Versión 9.0.3). Todos los valores se expresaron como media y error estándar de la media (SEM), y P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Todos los protocolos y procedimientos en el estudio con animales y todos los experimentos descritos fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la facultad de medicina veterinaria de la Universidad de Teherán (ID de aprobación: IR.UT.VETMED.REC.1401.006), que estaba de acuerdo con los principios éticos. principios y normas y estándares nacionales para realizar investigaciones médicas en Irán. El protocolo para el ensayo de hemólisis en seres humanos fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación Biomédica (Universidad de Teherán). Para proporcionar muestras de sangre entera fresca, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los donantes antes de cualquier participación voluntaria en el estudio. Después del experimento, las muestras de sangre fueron destruidas. No se tomaron los nombres ni las especificaciones personales de los participantes individuales.

Antes del aislamiento de la membrana celular, el fenotipo de los monocitos se confirmó mediante la existencia del biomarcador CD14 mediante análisis de citometría de flujo. Además, se evaluaron los modos celulares en diferentes condiciones, incluida la pureza celular y la apoptosis, la necrosis y la viabilidad celular. Más de aproximadamente el 90 % de la población de células aisladas controladas mostró un fenotipo CD14+ (monocitos) con una viabilidad superior al 90 % (sin apoptosis ni necrosis).

La nanopartícula PLGA obtenida mediante el método mencionado se sintetizó con éxito. Como se muestra (Fig. 2A), se midió el tamaño hidrodinámico medio de 189,5 nm para NP utilizando DLS con la dispersión de tamaño deseada (PDI = 0,176). Además, el potencial zeta del NP fue -34,1 cuando se midió con un zetasizador. El recubrimiento de la nanopartícula de PLGA mediante una membrana de monocitos se realizó utilizando un método de extrusión basado en filtros de policarbonato. En comparación con las NP desnudas, se obtuvieron un tamaño y un potencial zeta de 292 nm y −10 para las NP recubiertas con membrana celular (Fig. 2B).

Tamaño hidrodinámico de nanopartículas de PLGA (A) y nanofantasmas (B) mediante medición DLS; Micrografía TEM (C) y SEM (D) de NG cargado con fármaco.

Además, el resultado de la medición del tamaño utilizando SEM mostró un diámetro de aproximadamente 50 nm, mientras que se estimaron diámetros de 62,5 y 5 nm para NG y cáscara tras la determinación del tamaño de partícula mediante TEM, respectivamente (Fig. 2C, D).

De acuerdo con la cuantificación del contenido de ácido siálico mediante procedimiento enzimático a 570 nm, este contenido para el sobrenadante de NG fue del 98% en comparación con el de la membrana de monocitos (100%) y la solución de PLGA NP (cero), lo que indica lado derecho hacia afuera. orientación de la membrana (Fig. 2 complementaria).

La cantidad de GL en la solución de carga del fármaco, así como las muestras de disolución, se calcularon frente a las soluciones estándar de GL (Tabla complementaria 1). Para ello, se trazó la curva de calibración para soluciones estándar de GL en PBS como se muestra en la figura complementaria S2. Al respecto se obtuvo un porcentaje de carga del 4,68% para el GN. Además, la liberación repentina de GL (más del 85,3%) se produjo después de 24 min, seguida de una tendencia de liberación sostenida hasta las 144 h (100%), como se muestra en la Fig. 3A.

(A) Perfil de liberación de gliclazida de nanofantasmas (NG); (B) Actividad hemolítica de nanofantasmas basados ​​en monocitos cargados con fármacos. Las barras de error muestran la desviación estándar de mediciones por triplicado y (C) demuestra los porcentajes hemolíticos de glóbulos rojos expuestos a diferentes concentraciones de NG en comparación con los controles positivos y negativos.

La actividad hemolítica de los glóbulos rojos expuestos a diferentes concentraciones de NG mostró un 1,22% de hemólisis en una concentración máxima de aproximadamente 250 μg/ml. La hemólisis más baja se observó a una concentración inferior a aproximadamente 2 μg/ml (Fig. 3B, C).

Se examinó el ensayo de citoquinas in vitro en el sobrenadante del cultivo celular para evaluar la bioactividad del TNF. Los niveles de TNFα después de la exposición a NG y NP disminuyeron a aproximadamente 9,6 y 8,2 veces en comparación con las células inducidas por LPS como control positivo (Fig. 4A).

(A) Ensayo de TNFα de NG/NP cargado con GL en monocitos inducidos por LPS. Los resultados se expresaron por concentración (pg/ml) en comparación con el control. Los datos representan la media ± DE (n = 3); (B) Niveles de expresión de Caspasa1, Caspasa3, Caspasa8, Caspasa9, NLRP3, NOS, MYD88, IL-1beta e IL-18 para monocitos preparados con LPS expuestos a nanofantasmas (NG) y nanopartículas (NP) en comparación con monocitos preparados con LPS. Los datos representan la media ± DE (n = 3). *Valor de p < 0,05.

Para investigar el efecto de NP y NG cargados con GL en los niveles de expresión de genes en monocitos, en comparación con las células tratadas con PBS y preparadas con LPS como controles negativos y positivos, respectivamente, se realizó una prueba de RT-PCR a nivel de ARNm.

Como se ilustra secuencialmente en la Fig. 4B, los niveles de expresión de C1, C3, C8, C9, NOS, MyD88, NLRP3, IL-1β e IL-18 se atenuaron 1,23, 4,29, 1,18, 2,50, 1,05, 10,00, 11,11, 1,37. y 1,41 veces en los monocitos que fueron expuestos a NG cargado con GL, en comparación con el control positivo. Esta disminución para el tratamiento con NP fue de 1,03, 1,02, 1,12, 1,03, 1,04, 1,67, 3,33, 1,06, 1,03 veces para la expresión del mismo orden de genes, respectivamente. Cabe señalar que la disminución en el nivel de NLRP3 para las células expuestas a NG y NP mostró una inhibición de la inflamación mediada por antiinflamasomas (Fig. 4B).

Antes de investigar la eficacia terapéutica de NG/NP en el modelo de conejo aterosclerótico, se realizó el experimento de toxicidad sistémica para la administración de NG y PLGA NP. La toxicidad sistemática tras el control del peso para la administración de NP y en los grupos tratados con NG y NP en comparación con el grupo de control no mostró toxicidad significativa (Fig. 5A).

(A) La evaluación de la toxicidad sistémica de nanoghost (NP) y nanopartículas (NG) (100 μL de NP y NG que contienen 6 μg de GL) para conejos tratados con NG/NP, en comparación con grupos de control tras el seguimiento del peso durante un mes (n = 8 para cada grupo, valor P < 0,05). (B) El perfil GL in vivo de NG y PLGA NP cargados con fármaco en el estudio farmacocinético. Se inyectaron por vía intravenosa 100 μl de NP y NG que contenían 2,88 μg de GL. Los datos representan la media ± DE (n = 3).

Además, las dosis de nanopartículas se determinaron después del análisis farmacocinético del NG/PLGA NP cargado con fármaco administrado por vía intravenosa (Fig. 5B). Se calcularon todos los parámetros, incluidos Cmax, Ke, t1/2 y Vd. La frecuencia de administración de NP fue de acuerdo a t1/2. En otras palabras, de acuerdo con la Tabla complementaria 3, debido a que la vida media de eliminación calculada para NG y NP cargados con GL fue de 48,5 h y 26,6 h, respectivamente, PLGA NP se administró diariamente, mientras que NG se administró en intervalos de 2 días.

El análisis bioquímico mostró niveles más altos de colesterol en los conejos de control positivo exactamente antes de la medicación (máx. = 963 mmol/L) en comparación con los días iniciales (Figura 4 complementaria). Además, los niveles de TG aumentaron simultáneamente. El nivel de glucosa fue casi constante después del tratamiento con NG, lo que indica la seguridad de NG ante la preocupación de los diabéticos en estudios con animales a la concentración de glucosa dada (93 mg/dl). Además, la alteración no significativa en los niveles de AST y ALT no indicó daño hepático (Figura complementaria 4).

Al final del experimento (cuarta semana después de la medicación), se tomó la sección de la aorta para el análisis histológico de las placas ateroscleróticas ubicadas en la raíz de la aorta. Se realizaron tinciones con hematoxilina y eosina (H&E), así como inmunotinción utilizando anticuerpos marcados con 3, 3'-diaminobencidina (DAB) para identificar la infiltración de monocitos y los fenotipos de macrófagos. En este sentido, se investigó la expresión de biomarcadores como CD14, CD68 y CD163 en secciones de aorta con placa aterosclerótica. El análisis estadístico relacionado y las fotografías se muestran en la Fig. 6. Como se muestra en la Fig. 6A, el contenido de macrófagos como abundancia de CD14+ en el área íntima de la aorta para el grupo positivo o el grupo de placa inducida (46,98%, valor de P <0,01) disminuyó. a aproximadamente 11,4% (valor de P <0,01) y 7,7% (valor de P <0,01) tras el tratamiento con NP y NG, respectivamente. Además, según la Fig. 6B, la proporción CD163:CD68 en el grupo tratado con NP y NG aumentó a aproximadamente 1,1 y 1,23 respectivamente, en comparación con el grupo positivo, que fue 0,65 veces, lo que indica la polarización de los macrófagos de inflamatorio/M1 a anti- Fenotipo inflamatorio/M2. La medición del área de superficie total también se realizó en la superficie íntima para estimar el alcance de la aterosclerosis. El área de la placa disminuyó 14,4 veces (valor de P <0,01) tras el tratamiento con NG en comparación con el grupo positivo (Fig. 6C). Esta disminución fue de aproximadamente 6,4 veces para el grupo tratado con NP (valor de P <0,01). Como se muestra en la Fig. 6D, E, el porcentaje total de células espumosas disminuyó a aproximadamente 1,4 y 2,9 veces para el grupo tratado con NP y NG en comparación con el grupo positivo (valor de P <0,05 y <0,01), respectivamente.

Estimación semicuantitativa del porcentaje de células CD14+ (A); Relación CD163:CD68 (B) mediante análisis de histo/inmunohistoquímica; Estimación del área de superficie (μm2) en el área íntima de las placas utilizando el software Optika (× 64, 4.11.18081.20201205 (C). Estimación del porcentaje de células espumosas (D) para los grupos tratados con NG/NP, en comparación con el grupo normal y positivo (Los valores de P para todos los grupos versus los controles positivos relacionados se etiquetaron con * y **, que indican menos de 0,05 y 0,01, respectivamente; α = 0,05). Los datos representan la media ± DE (n = 3). Hematoxilina-eosina e inmunorrepresentantes -tinción histoquímica (E) para las secciones de aorta en el grupo de conejos alimentados con pienso sin colesterol/control negativo (a), grupo tratado con NP (b), grupo tratado con NG (c) y grupo positivo (d). Flechas negras en Eb, Ec y Ed muestran la ubicación de las células espumosas. Se inyectaron 100 μL de NG y NP que contenían aproximadamente 48 ng/mL de gliclazida en cada grupo (n = 8) diariamente y cada 2 días durante 4 semanas, respectivamente.

La tinción H&D del hígado y el riñón de todos los grupos también se muestra en la Fig. 4 complementaria. No se observaron problemas patológicos en las secciones de hígado y riñón en el grupo de conejos alimentados con alimento sin colesterol/control negativo (Fig. 4A complementaria). Todas las observaciones patológicas mencionadas disminuyeron para NP (Fig. 4B complementaria) y el grupo tratado con NG (Fig. 4C complementaria). Sin embargo, se detectó cierto grado de células espumosas y linfocitos intersticiales en secciones de hígado del grupo tratado con NP. En comparación con los grupos de control positivo, no se observaron problemas patológicos en las secciones de riñón para los grupos tratados con NG/NP y de control negativo (Fig. 4B, C complementaria).

Después de la investigación de los tejidos hepáticos teñidos, en comparación con el grupo de control normal, se observaron inflamación, necrosis, número de células de kupffer, hiperplasia y hepatitis provisional en la sección del hígado de conejos de control positivo (Fig. 4D complementaria). Este grupo también mostró necrosis confluente con colestasis biliar.

En la aterosclerosis, la inestabilidad y el daño de la placa pueden provocar un ataque cardíaco, un derrame cerebral y, finalmente, la muerte10. Uno de los aspectos más importantes de la enfermedad son los problemas inmunológicos y la inflamación. Como los fármacos antiinflamatorios no reciben mucha atención clínica en pacientes con aterosclerosis, existe la necesidad de desarrollar terapias más eficaces, teniendo en cuenta los aspectos inflamatorios. Por ejemplo, atacar los inflamasomas NLRP3 en monocitos y macrófagos se conoce como una terapia novedosa para inhibir la inflamación29.

Dentro de la placa aterosclerótica, la expresión del inflamasoma NLRP3 está elevada en los macrófagos y las células espumosas. Por lo tanto, la aplicación de agentes inflamasómicos anti-NLRP3 se ha considerado como un enfoque atractivo para prevenir la formación de placa30. Hoy en día, los derivados de sulfonilurea son conocidos como fármacos antiinflamasómicos eficaces31. En este sentido, en el estudio se seleccionó GL como agente antiinflamatorio para el tratamiento de la aterosclerosis32.

Uno de los principales inconvenientes del fármaco es su baja solubilidad y su liberación incontrolada. Para superar estos inconvenientes, se encapsuló GL en nanopartículas de PLGA como un polímero aprobado por la FDA33. El uso de la plataforma de nanopartículas no sólo ha resuelto el problema de la solubilidad del fármaco, sino que también ha mejorado la inhibición de la inflamación en estudios tanto in vitro como in vivo.

Debido a que las placas ateroscleróticas tienen orígenes celulares e inflamatorios y también para su tratamiento, la vida media de los fármacos en el sistema circulatorio es importante, los científicos han considerado el desarrollo de sistemas de administración de fármacos basados ​​en biomiméticos. Un sistema de administración de fármacos (DDS) de este tipo no sólo puede eliminar los obstáculos resultantes de la detección inmunológica mediante el sistema reticuloendotelial (RES) y su posterior eliminación rápida, sino que también puede adquirir un aspecto de administración sostenida, así como una localización inmunológica hacia el tejido. El enfoque elimina la necesidad de apuntar a agentes y bioconjugación. Durante muchos años, el PEG ha sido conocido como un potente agente sigiloso para los sistemas de administración de nanofármacos para garantizar un largo tiempo de circulación de los fármacos mediante el escape del RES. Estudios recientes han informado de la aparición de anticuerpos anti-PEG en la sangre de un paciente que experimentó medicación con formas farmacéuticas basadas en PEG34. Por lo tanto, se está considerando una estrategia alternativa debido a la ineficiencia del DDS35 recubierto con PEG. En este sentido, se ha desarrollado el DDS recubierto de membrana celular como una nueva estrategia biomimética36,37. Lógicamente, las células implicadas en el desarrollo de la placa aterosclerótica pueden utilizarse como materiales de partida para el DDS biomimético. Los monocitos y los macrófagos son las células inmunitarias más importantes que desempeñan funciones patológicas en la formación de la placa aterosclerótica. Se sabe que los monocitos (macrófagos) migran al sitio de formación de la placa, convirtiéndose en células espumosas y provocando la apoptosis tras la absorción de ox-LDL18.

En consecuencia, en nuestro estudio, se asumió que el uso de membranas celulares derivadas de monocitos como células clave en la formación de placas ateroscleróticas era el mejor enfoque para construir nanopartículas de PLGA cargadas de fármacos biomiméticos. Dicho NG antiinflamatorio se acumulará en los tejidos inflamados después del antígeno de membrana asociado con la unión y el secuestro de citoquinas proinflamatorias. Posteriormente, un fármaco antiinflamatorio liberado por NG produjo un efecto sinérgico contra los aspectos inmunológicos de la aterosclerosis.

Nuestro NG se fabricó con éxito con una morfología redonda utilizando un método basado en extrusión aplicado a homogeneizados de membrana celular y nanopartículas de PLGA. Una capa obvia observada usando TEM de acuerdo con otras evidencias, el tamaño alterado y el potencial zeta de las nanopartículas recubiertas de membrana celular en comparación con las no recubiertas, confirmó el recubrimiento de la membrana celular de las nanopartículas de PLGA. El tamaño más pequeño del NG medido por TEM que el medido por DLS se debe al mayor radio hidrodinámico en la medición DLS en comparación con el tamaño real de TEM. Los resultados del perfil de disolución mostraron una liberación suficiente de GL desde NG en intervalos de tiempo, lo que garantiza la administración del fármaco y un efecto antiinflamatorio al localizarse en la placa.

Además, la actividad hemolítica no significativa no solo del NG sino también del núcleo PLGA NP, incluso en concentraciones superiores a las aplicadas, indicó una excelente hemocompatibilidad (<2) del DDS para el estudio en animales. En nuestro estudio, se observó el nivel de expresión genética más bajo entre los genes para NLRP3, lo que indica la poderosa capacidad del nanoghost cargado de GL en la inhibición del inflamasoma. Además, el resultado, junto con la expresión atenuada de otros genes inflamatorios, demostró que el DDS tiene el potencial de prevenir la inflamación en la placa de aterosclerosis.

La probable pérdida de peso de los conejos durante un mes de administración de NP y NG no mostró ninguna disminución ni interrupción en el aumento de peso de los animales en comparación con el grupo de control (inyección de PBS). En otras palabras, la tendencia ascendente en el aumento de peso en una pendiente similar con el grupo de control para PLGA NP así como para los conejos tratados con NG no indicó toxicidad sistemática tras un mes de inyección terapéutica continua. En consecuencia, el estudio farmacocinético sobre la concentración segura de NG/NP cargado con GL reveló la vida media del fármaco para el ajuste de dosis38.

Después del estudio en animales, el núcleo menos necrótico en el arco aórtico en los conejos tratados con NG indicó la eficacia deseada de la NG cargada con GL para la terapia de la aterosclerosis. La reducción de las células espumosas, los macrófagos cargados de lípidos y los depósitos minerales en la túnica media, así como menos problemas patológicos en las secciones de hígado y riñón, demostraron que el NG cargado con fármaco ha inhibido eficazmente el desarrollo de placa en el modelo de aterosclerosis en conejos. Nuestro estudio sugiere que la NG biomimética es eficaz para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, lo que concuerda con la conclusión de otros37. Además, al igual que otros39, ningún signo de hiperplasia en el área de la placa en los grupos tratados con NG/NP confirmó los resultados del estudio de un balón recubierto de fármaco para el tratamiento de la aterosclerosis39.

Se calculó un recuento medio más alto de células CD14 positivas para el control positivo (grupo no tratado alimentado con una dieta enriquecida en colesterol) que el control normal, lo que indica el estado inflamatorio de la placa. La subpoblación CD14 positiva disminuyó con el tratamiento con NP y NG, respectivamente, mejorando los aspectos inflamatorios de la aterosclerosis. El resultado confirmó la observación de la terapia con paclitaxel para las lesiones de aterosclerosis inducidas por el colesterol en conejos26. Además, el mayor porcentaje de macrófagos positivos para CD163 que de macrófagos positivos para CD68 para los grupos tratados con NP y NG, respectivamente, en comparación con el control positivo, puede mostrar polarización de M1 a M2, así como una fase antiinflamatoria después del tratamiento (valores de P <0,05). . Sin embargo, este efecto fue ligeramente más fuerte en el grupo tratado con NG. En comparación, la proporción CD68/CD163 para el control positivo indicó una fase más proinflamatoria.

La disminución de los niveles de TG y colesterol en sangre después de la exposición a NG/NP en comparación con el grupo positivo mostró una correlación directa con la disminución del tamaño de las placas, así como de las células espumosas cargadas de lípidos. Sin embargo, es necesario examinar resultados adicionales para una identificación clara de los macrófagos cargados de lípidos en la placa aterosclerótica.

En conjunto, el novedoso DDS desarrollado, NG encapsulado en GL, tiene potencial en las clínicas para la terapia con medicina personalizada de los aspectos inflamatorios de la aterosclerosis. Esta plataforma regula a la baja la expresión genética de algunas moléculas relacionadas con la inflamación, disminuye los núcleos necróticos y los problemas patológicos pueden aumentar la proporción de macrófagos M2/M1. El DDS también sería una plataforma prometedora para el tratamiento de otras enfermedades inflamatorias. Suponemos que la funcionalización de la plataforma NG ofrece otras ventajas para apuntar con precisión al tejido inflamatorio, especialmente a la endotelia vascular.

En resumen, desarrollamos y caracterizamos con éxito la plataforma NG basada en monocitos en la que la nanopartícula PLGA cargada con GL central estaba rodeada por una membrana celular biomimética derivada de monocitos. Este nanoportador bio/hemocompatible atenuó la expresión de genes inflamatorios como TNFα, IL-1β e IL-18. Sin embargo, el nivel de expresión más bajo para el gen NLRP3 introdujo el NG cargado con GL como una potente plataforma antiinflamasoma. Este NG no solo disminuyó la inflamación, sino que también disminuyó los niveles sanguíneos de TG y colesterol, las células espumosas totales, el tamaño de la placa y los problemas patológicos en el área de la aorta después de la entrega de GL. El equilibrio de los problemas patológicos con la proporción de fenotipo M2/M1 después del tratamiento con NG se dirigió hacia la fase antiinflamatoria. El NG cargado de GL basado en membrana de monocitos puede introducirse como un candidato biomimético prometedor para controlar los aspectos inflamatorios y la inmunoterapia de la aterosclerosis.

Algunos conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Estamos muy agradecidos por el apoyo financiero de Asuntos de Investigación de la Universidad de Teherán. También nos gustaría agradecer al Dr. Mehdi Gholami, al Sr. Ahmad Hajiesfandiari, a Morteza Hasheminia y a la Sra. Manigeh Khandayie Ghamsari por su valioso apoyo.

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Teherán, Teherán, Irán

Zahra Karami y Jalil Mehrzad

Departamento de Biomateriales Farmacéuticos y Centro de Investigación de Biomateriales Médicos, Facultad de Farmacia, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán e Instituto de Biomateriales, Universidad de Teherán y Universidad de Ciencias Médicas de Teherán (IBUTUMS), Teherán, Irán

Mohamed Akrami

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Tarbiat Modares, Teherán, Irán

Saman Hosseinkhani

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JM (investigador principal), ZK (estudiante de doctorado en Inmunología) y MA, recopilaron los datos, realizaron los tratamientos, diseñaron, escribieron y finalizaron el estudio, y JM y MA también son corresponsales. SH revisó los análisis estadísticos, apoyó la recopilación de datos y revisó críticamente el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Jalil Mehrzad o Mohammad Akrami.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Karami, Z., Mehrzad, J., Akrami, M. et al. Tratamiento antiinflamatorio de la aterosclerosis utilizando nanofantasmas biomiméticos cargados con gliclazida. Representante científico 13, 13880 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41136-y

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Recibido: 26 de septiembre de 2022

Aceptado: 22 de agosto de 2023

Publicado: 24 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41136-y

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