Papel de la glicosilación de mucina en la microbiota intestinal

Oct 15, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13982 (2023) Citar este artículo

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Las alteraciones en la glicosilación de la mucina intestinal se han asociado con una mayor permeabilidad intestinal y sensibilidad a la inflamación y la infección. Aquí, utilizamos ratones que carecían de O-glicanos derivados del núcleo 3 (C3GnT-/-) para investigar el efecto de la glicosilación de mucina alterada en el eje intestino-cerebro. Los ratones C3GnT-/- mostraron metabolitos microbianos alterados en el ciego asociados con la función cerebral, como los perfiles de dimetilglicina y N-acetil-l-tirosina, en comparación con los compañeros de camada C3GnT+/+. En el cerebro, las células granulares positivas para la molécula de adhesión de células neuronales polisialiladas (PSA-NCAM) mostraron un fenotipo aberrante en la circunvolución dentada de ratones C3GnT-/-. Esto estuvo acompañado por una tendencia hacia niveles de expresión disminuidos de PSA, así como de ZO-1 y ocludina en comparación con C3GnT+/+. Los estudios de comportamiento mostraron una disminución en la memoria de reconocimiento de los ratones C3GnT-/- en comparación con los ratones C3GnT+/+. Combinados, estos resultados respaldan el papel de la O-glicosilación de mucina en el intestino para influir potencialmente en la función cerebral, lo que puede verse facilitado por el paso de metabolitos microbianos a través de una barrera intestinal deteriorada.

El tracto gastrointestinal (GI) alberga una compleja comunidad microbiana de bacterias, arqueas y eukarya, conocidas colectivamente como microbiota intestinal, que influye en el equilibrio entre la salud y la aparición de enfermedades intestinales y extraintestinales1. En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que el microbioma intestinal participa en la señalización del intestino-cerebro, lo que ha llevado a la aparición de un concepto de eje microbiota intestinal-cerebro2,3. La creciente evidencia preclínica sugiere ampliamente que la microbiota intestinal puede modular el desarrollo, la función y el comportamiento del cerebro a través de vías inmunes, metabólicas y neuronales4. Durante la disbiosis, estas vías están desreguladas y asociadas con una permeabilidad alterada de la barrera hematoencefálica (BHE) y neuroinflamación5.

La estructura y función de la microbiota intestinal varía a lo largo del tracto gastrointestinal, pero también desde la luz hasta la mucosa6. En el colon, el moco que cubre el epitelio es fundamental para la homeostasis intestinal al albergar una comunidad microbiana a una distancia segura de la superficie del epitelio7. La mucina O-glicanos intestinales, los principales componentes estructurales del moco, proporcionan sitios de unión y una fuente sostenible de nutrientes para las bacterias que habitan el nicho del moco8,9,10, contribuyendo así a la organización espacial de la microbiota intestinal11,12. La O-glicosilación de mucina se inicia mediante la adición de un residuo de N-acetilgalactosamina (GalNAc) al grupo hidroxilo de la serina o treonina, lo que da como resultado la formación del antígeno Tn, que representa el sustrato para futuras adiciones de azúcares por parte de las glicosiltransferasas. La adición de galactosa (Gal) al antígeno Tn da como resultado la formación del núcleo 1 (Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr), mientras que la adición de N-acetilglucosamina (GlcNAc) al antígeno Tn da como resultado el núcleo 3 (GlcNAc-β1- Estructura 3GalNAcα-Ser/Thr). La extensión adicional del núcleo 1 y el núcleo 3 con residuos de GlcNAc por la acción de la β1,6 N-acetilglucosaminiltransferasa da lugar al núcleo 2 (Galβ1,3(GlcNAcβ1,6)GalNAcα1-Ser/Thr) y al núcleo 4 (GlcNAcβ1,6 (GlcNAcβ1,3)GalNAcαSer/Thr), respectivamente13. La distribución de las estructuras centrales de mucina varía a lo largo del tracto gastrointestinal, lo que se debe en parte a los patrones de expresión específicos de órganos de las glicosiltransferasas centrales14. Las estructuras del núcleo 1 y 2 son típicas de las mucinas gástricas y duodenales, mientras que las estructuras del núcleo 3 y 4 son abundantes en las mucinas del colon14,15,16. En condiciones homeostáticas, estas estructuras centrales de mucina se alargan aún más mediante la adición de monosacáridos17 y las cadenas de mucina-glicano generalmente terminan con residuos de sulfato, ácido siálico o fucosa, lo que da como resultado estructuras de oligosacáridos muy diversas13,18,19.

La modificación de la O-glicosilación de la mucina provoca una alteración de las interacciones huésped-microbio y de la inmunidad de la mucosa, lo que contribuye a comprometer la barrera intestinal y a enfermedades asociadas, como las enfermedades inflamatorias intestinales (EII)11,20,21,22. Comprender el papel de la glicosilación de mucina en la salud y las enfermedades es un desafío, debido a la gran diversidad de estructuras de O-glicano y vías enzimáticas que regulan la maquinaria de O-glicosilación23. Sin embargo, en los últimos años, los ratones knockout para glicosiltransferasa, que muestran defectos en la glicosilación, han sido fundamentales para demostrar el papel causal de los O-glicanos en varios procesos fisiológicos. Los ratones que carecen de O-glicanos derivados del núcleo 3 (C3GnT-/-) mostraron una mayor susceptibilidad a la colitis y el cáncer de colon inducidos químicamente, pero a diferencia de los ratones que carecen de O-glicanos derivados del núcleo 1 intestinal (IEC C1galt1-/-), no desarrollan colitis espontánea20,24,25,26. El defecto de glicosilación en estos modelos de ratón condujo a una reducción de la proteína Muc2 y a una capa mucosa externa más delgada, lo que provocó un aumento de la permeabilidad intestinal y una mayor capacidad de respuesta a las infecciones, debido al contacto directo de la microbiota intestinal con la capa de epitelio24. Además, mientras que C1galt1 se expresa de forma ubicua, C3GnT se expresa más intensamente en el colon proximal25. Curiosamente, el número de células caliciformes permanece inalterado en estos modelos animales transgénicos, lo que sugiere que la deficiencia en la glicosilación de mucina es suficiente para alterar la barrera del epitelio intestinal26,27.

Un “intestino permeable” puede contribuir a las vías de señalización clave que median en el eje microbiota intestinal-cerebro28. Una barrera intestinal comprometida permite una participación más amplia del sistema inmunológico, pero también debilita la contención de productos microbianos, que pueden filtrarse del intestino a la circulación, lo que resulta en una inflamación crónica de bajo grado2 que se observa en los trastornos neurológicos29. La función de la barrera intestinal se preserva mediante múltiples capas protectoras, incluida la microbiota intestinal, la capa mucosa y las células epiteliales e inmunes, pero no se ha investigado el papel de la glicosilación de la mucina en el eje microbiota intestinal-cerebro. Aquí, utilizamos ratones C3GnT-/- como modelo para investigar el efecto de la glicosilación de mucina alterada en el intestino sobre la función cerebral y el comportamiento neurológico.

Trabajos anteriores demostraron que la eliminación del gen C3GnT (que codifica la 3 beta1,3 N-acetilglucoaminiltransferasa central, también conocida como B3GNT6 UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa 6) eliminó los O-glicanos derivados de 3 centrales y significativamente redujeron los O-glicanos intestinales totales26 con Muc2 de ratones C3GnT-/- que portan una mezcla de glicanos de tipo núcleo 1 o núcleo 213. Aquí, primero confirmamos que el gen C3GnT se expresaba principalmente en el colon proximal de los ratones C3GnT+/+, en comparación con los ratones C3GnT-/-, sin que se detectara expresión en el cerebro de ambos genotipos (Fig. S1). Luego investigamos la relación entre los cambios en la glicosilación de mucina y el perfil de la microbiota intestinal en compañeros de camada C3GnT-/- y C3GnT+/+. MALDI-TOF analizó el perfil de glicosilación de mucinas purificadas de compañeros de camada después de la liberación de glicanos mediante β-eliminación reductora y permetilación. El análisis confirmó que la falta de glicanos derivados de O del núcleo 3 afectó la abundancia relativa de la composición de O-glicano en las mucinas solubles del colon (Fig. 1). Luego se determinó la abundancia de glucanos como la relación entre el área de cada pico de glucano identificado y la suma de todos los picos de glucano identificados por muestra. En general, el porcentaje de glicanos sialilados fue similar entre los ratones C3GnT-/- y los ratones C3GnT+/+ (71,1% para C3GnT-/- frente a 69,2% para C3GnT+/+), mientras que se observó una marcada disminución en la abundancia de glicanos fucosilados en los ratones C3GnT-/- (21,4%) en comparación con los ratones C3GnT+/+ (49,7%). Hubo un bajo porcentaje de sulfatación en ambos grupos de ratones (1,85% para C3GnT+/+ y 2,98% para C3GnT-/-). Los espectros de fragmentación de los glicanos también mostraron niveles alterados de estructuras de glicanos, distintas del núcleo 3 o el núcleo 4, ya que la falta de glicanos derivados del núcleo 3 O impidió la síntesis adicional de los glicanos del núcleo 430. Por ejemplo, el pico de glicano a 1590 Da correspondiente a glicanos compuestos por un Neu5Ac, tres N-acetil-hexosaminas y dos unidades de hexosa se encontró tanto en C3GnT+/+ como en C3GnT-/-, pero hubo marcadas diferencias en los espectros de fragmentación, tales como como la presencia del pico m/z 694 en la muestra C3GnT+/+ y el pico m/z 955 y 1314 en la muestra C3GnT-/-, lo que indica diferencias en los enlaces entre monosacáridos de estas estructuras de glicano (Fig. S2).

Abundancia relativa de glicanos en mucinas solubles del colon. Gráfico que muestra la abundancia de glicanos de diferente composición en mucinas solubles de ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+.

La microbiota intestinal del moco raspado del colon (también utilizado para el perfil de glicosilación de mucina) y muestras fecales de ratones C3GnT-/- y compañeros de camada de ratones C3GnT+/+ se analizaron mediante la secuenciación de la región variable V3-V4 del ADNr 16S. A nivel de filo, los componentes dominantes fueron miembros de Firmicutes/Bacillota y Bacteroidetes/Bacteroidota sin diferencias importantes en los filos entre los ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+, ya sea en muestras fecales a los 21 (Tiempo 1) y 75 días ( Tiempo 2) después del nacimiento o en moco raspado (Fig. 2A). No hubo evidencia de diferencias en la diversidad α entre los grupos en muestras fecales o en moco (recuentos de OTU observados, índice de Shannon e índice de Simpson). La diversidad β de las muestras fecales y de moco se calculó utilizando la distancia Unifrac y Bray-Curtis, y se trazaron las ordenaciones, estratificadas por punto de muestra para cada medición. PERMANOVA no mostró evidencia de diferencias en la composición entre grupos en ningún punto de muestra (Fig. 2B). Al comparar las abundancias a nivel familiar, Lachnospiraceae y Lactobacillacea fueron las familias más dominantes en el moco y en el sedimento fecal de 75 días de ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+ (Fig. 2C). En promedio entre los puntos de muestra, el 48% de las lecturas se atribuyeron a Lachnospiraceae en ratones C3GnT+/+, en comparación con el 38% en ratones C3GnT-/-. Hubo un aumento correspondiente en Lactobacillaceae en ratones C3GnT-/- donde la abundancia relativa fue del 22 % frente al 14 % en ratones C3GnT+/+ (Fig. 2C, Tabla S1). El análisis utilizando Deseq2 proporcionó cierta evidencia de que la abundancia relativa de Lactobacillaceae en muestras fecales de 75 días fue mayor en C3GnT-/- después de múltiples correcciones de prueba (cambio log2 = 1,7; p = 0,004; q = 0,085), con un resultado similar. magnitud de la diferencia observada en las muestras de moco (log2 veces de cambio = 1,56; p = 0,027; q = 0,31). Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas cuando se compararon utilizando enfoques alternativos para la abundancia diferencial, incluido el análisis de regresión lineal de abundancias relativas o proporciones logarítmicas centradas.

Composición de la microbiota intestinal a partir de moco raspado y muestras fecales de ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+. (A) Gráfico de barras de la composición de la microbiota intestinal a nivel de filo a partir de moco raspado en el tiempo 2 y pellet fecal en el tiempo 1 y 2 de ratones C3GnT-/- (n = 12) y C3GnT+/+ (n = 15). (B) Gráfico de ordenación de PCoA con disimilitud de Bray-Curtis (C) Tabla que indica las familias bacterianas más abundantes agrupadas por genotipo (C3GnT-/- y C3GnT+/+) y expresadas por porcentajes en el moco raspado y el sedimento fecal en el Tiempo 2.

En línea con resultados anteriores, mostramos un aumento en la permeabilidad intestinal en C3GnT-/- en comparación con los compañeros de camada C3GnT+/+ usando FITC-dextrano administrado por sonda oral, lo que respalda el papel de los O-glicanos derivados del núcleo 3 en el mantenimiento de la integridad de la mucosa26 (Figura S3).

Para determinar la consecuencia de la función de barrera de O-glicosilación de mucina intestinal alterada en la plasticidad neural que ocurre en el hipocampo, nos centramos en el fenotipo de las células granulares que expresan PSA-NCAM en la circunvolución dentada (DG) de C57BL/6 de tipo salvaje (WT). ) y ratones C3GnT-/-. Se analizaron entre 4 y 7 secciones por ratón (desde - 1,58 mm rostral/dorsal hasta - 2,54 mm en posición Bregma caudal/ventral) en cada uno de los dos grupos (Fig. S4). Desde la posición dorsal a la ventral del hipocampo, las células granulares inmaduras PSA-NCAM positivas (PSA-NCAM+), células en proliferación que apoyan la neurogénesis en el DG31,32, mostraron un fenotipo aberrante en los ratones C3GnT-/-, con neuritas cortas y desorganizadas que se proyectan hacia la capa molecular superior, mientras que, en ratones WT, las células PSA-NCAM+ mostraron una morfología polarizada típica con extensas ramas de dendritas apicales que alcanzan la capa molecular anterior (Fig. 3A). Al realizar un recuento comparativo de las células granulares de PSA-NCAM+ en la zona subgranular (SGZ), los ratones C3GnT-/- tuvieron menos células positivas por sección (promedio medio = 52,0, se = 8,0) en comparación con los ratones WT (promedio medio = 76,4, se = 8,0) aunque no fue estadísticamente significativo (p = 0,09) cuando se analizó más detalladamente utilizando un modelo lineal mixto con efecto aleatorio de ratón (Fig. 3B). Sin embargo, esta desregulación observada de las células granulares de PSA-NCAM+ en el DG de ratones C3GnT-/- estaba en línea con la disminución en el contenido de ácido polisiálico en los lisados ​​cerebrales de ratones C3GnT-/- en comparación con los compañeros de camada C3GnT+/+, según lo determinado por inmunotransferencia (Fig. 3C) y se cuantificó mediante análisis de la intensidad de la banda (con un valor de intensidad medio de 11 para C3GnT-/- y 21 para C3GnT+/+) (Fig. 3D), mientras que no se observó ninguna alteración de los niveles de expresión de NCAM ni del patrón de isoformas. (Figura 3E).

Análisis de PSA-NCAM en el cerebro de compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT−/−. (A) Imágenes de inmunohistoquímica que muestran el fenotipo de las células PSA-NCAM+ en el DG de ratones C3GnT-/- y WT. Una fracción detallada de la parte dorsal de la DG (línea discontinua roja) muestra el fenotipo de las células granulares en ratones C3GnT-/- que exhiben dendritas más cortas y desorganizadas que parten de un soma celular agrandado (abajo a la izquierda), en comparación con los ratones WT donde la Se muestra la morfología polarizada típica con arborización completamente desarrollada que parte de las células del soma. (B) Las células PSA-NCAM+ aparecen disminuidas en el DG de C3GnT-/- aunque esta diferencia no es estadísticamente significativa (p = 0,13). Los resultados se presentan como media ± SEM. Las células PSA-NCAM+ se contaron en 4 a 7 portaobjetos por animal. Imágenes: objetivo 10×, barra de escala: 100 µm. Para el análisis de Western Blot, los lisados ​​​​se separaron mediante SDS-PAGE al 4-12% con 50 µg de proteína total por carril. Membrana de transferencia Western que muestra (C) expresión de PSA en extracto de cerebro y (D) cuantificación realizada con el software ImageLab. (E) Membrana de transferencia Western que muestra el patrón de isoforma NCAM después del tratamiento con endosialidasa. Se utilizó GAPDH como control.

Habiendo establecido que la morfología de las células granulares PSA-NCAM+ en el DG de ratones C3GnT-/- parecía estar desorganizada y atípica en comparación con los ratones WT, a continuación investigamos cómo esto puede relacionarse con el proceso de desarrollo, la plasticidad sináptica y la permeabilidad de la barrera en el cerebro de compañeros de camada C3GnT-/- y C3GnT+/+. El análisis de la expresión génica se realizó mediante RT-qPCR utilizando cebadores validados contra un panel de 14 genes diana y dos genes constitutivos (Gapdh, Tbp). Las diferencias en la expresión genética se ajustaron para ambos genes constitutivos. Los genes de interés se eligieron como una indicación de plasticidad sináptica, desarrollo neurológico y proliferación (BDNF, Creb1, NCAM1, Ki67), actividad polisialiltranferasa (ST8sia2, ST8sia4), formación de uniones estrechas y cadherina (ZO-1, Cldn1, Ocln, Cdh2). ), maduración de células granulares (GFAP, Prox1, NeuroD1) (Fig. S5). El cambio de expresión de cada gen en los compañeros de camada C3GnT-/- y C3GnT+/+ se informa con intervalos de confianza del 95% (Fig. 4). Hubo evidencia de que C3GnT-/- muestra una regulación negativa de la proteína 1 de unión al elemento sensible al AMPc (Creb1, FC = 0,748, valor de p = 0,04) y de genes asociados con el estado proliferativo de las células granulares, como la proteína ácida fibrilar glial (Gfap , FC = 0,664, valor de p = 0,015) aunque se perdió significancia después de corregir el valor de p por multiplicidad utilizando el método de Benjamini y Hochberg (Fig. 4). El análisis de transferencia Western mostró una tendencia hacia la reducción en la expresión de las proteínas de unión estrecha ZO-1 (Fig. 5A) y ocludina (Fig. 5B) en el cerebro de C3GnT-/- en comparación con los ratones C3GnT+/+, aunque la cuantificación fue no estadísticamente significativo a nivel de proteínas.

Análisis de expresión génica de dianas genéticas en el cerebro de compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT-/-. Los análisis se realizaron mediante RT-PCR. El tamaño del efecto es 2 elevado a la diferencia en Ct entre genotipos, ajustado por Ct de los genes constitutivos Gapdh y Tbp. Esto se interpreta como el cambio en la expresión entre genotipos, con valores bajos que sugieren una expresión más alta en C3GnT+/+ y valores altos que corresponden a una expresión más alta en C3GnT-/-. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95%.

Análisis de proteínas de unión estrecha en el cerebro de compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT−/−. Las proteínas de los lisados ​​cerebrales se separaron utilizando un SDS-PAGE del 4 al 12% con 50 µg de proteína total por carril. El análisis de transferencia Western mostró (A) ZO-1 y (B) ocludina. La cuantificación se llevó a cabo utilizando el software ImageLab. Se utilizó GAPDH como control.

Se llevó a cabo una metabolómica no dirigida para investigar la variedad de metabolitos afectados por la glicosilación alterada de la mucina. El análisis de componentes principales (PCA), realizado para obtener una visión comparativa general de los datos metabolómicos del cerebro y el contenido cecal, mostró cierta separación de las muestras C3GnT+/+ y C3GnT−/− en el cerebro (Fig. S6A) y una mayor segregación distintiva de muestras C3GnT -/- lejos de muestras C3GnT +/+ en el contenido cecal (Fig. S6B). Los análisis primarios de los datos mostraron diferencias en los metabolitos en el contenido cecal de ratones C3GnT+/+ y C3GnT−/−, como los metabolitos derivados de N-acetil-lisina, acetil-carnitinas, dimetilglicina y acetil-l-tirosina (Fig. 6). Luego, los valores de p se ajustaron para la corrección de pruebas múltiples utilizando la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg y los metabolitos se estratificaron de acuerdo con valores de p significativos de q <0,05. Este análisis mostró que 13 metabolitos diferían en concentración entre genotipos y los más significativos fueron generados por cuatro súper vías principales que incluyen aminoácidos (n = 9), cofactor y vitaminas (n = 1), lípidos (n = 2) y metabolismo de xenobióticos. (n = 1) (Figura S7).

Metabolitos en el ciego de compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT−/−. Los gráficos muestran la distribución de las concentraciones logarítmicas de metabolitos individuales que fueron significativas en q < 0,05 en el contenido cecal de los dos grupos de ratones (las concentraciones logarítmicas están estandarizadas para significar cero).

Los ratones C3GnT−/− y C3GnT+/+ fueron sometidos a tres pruebas de comportamiento diferentes: el nuevo reconocimiento de objetos (NOR) que prueba la memoria de reconocimiento, el laberinto Y para evaluar la memoria espacial y el campo abierto (OF) que analiza las funciones psicomotoras y la ansiedad. .

El test NOR es una prueba de conducta establecida para evaluar alteraciones de la memoria33, como la memoria de trabajo, la atención, la ansiedad y la preferencia por la novedad34. Después del paso de habituación y familiarización con dos objetos idénticos, los ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+ fueron expuestos a un objeto nuevo y a un objeto familiar. Si la memoria del sujeto de prueba funciona normalmente, el mouse pasará más tiempo explorando el objeto nuevo que explorando los objetos familiares (Fig. S8A). Si la exploración de todos los objetos es igual, este comportamiento será indicativo de un deterioro de la memoria35. El reconocimiento de objetos se evaluó mediante un índice de discriminación definido calculado en función del tiempo pasado con el objeto familiar y el nuevo. Aquí, los ratones C3GnT-/- mostraron una reducción significativa en el tiempo dedicado a explorar el nuevo objeto (p = 0,0183, prueba t no apareada de dos colas ± SEM) en comparación con los ratones C3GnT+/+ (Fig. 7A), lo que sugiere una deterioro de la memoria de reconocimiento. Como se muestra en el mapa de calor (Fig. 7B), C3GnT-/- pasó menos tiempo explorando el nuevo objeto en el laberinto, lo que indica una mala discriminación del nuevo objeto en comparación con el familiar. Se observó lo contrario en los ratones C3GnT+/+, que pasaron más tiempo con el nuevo objeto y exhibieron un comportamiento exploratorio típico.

Tareas de comportamiento realizadas por compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT−/−. Reconocimiento de objetos novedosos (NOR). (A) El índice de discriminación, calculado como (TN - TF)/(TN + TF), se utilizó para evaluar la preferencia por el objeto novedoso. También se muestran la distancia y la velocidad de la tarea. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 8/grupo) *p < 0,05. (B) La visualización del mapa de calor rastrea el tiempo que pasan los ratones cerca del objeto novedoso (flecha negra) y del objeto familiar ubicado en la esquina opuesta. El rojo representa un mayor tiempo invertido y el azul representa un tiempo mínimo invertido durante la prueba. Laberinto en Y (C) Diagramas de dispersión que muestran la distancia recorrida y la velocidad en los tres brazos del laberinto en Y por ambos grupos de ratones. (D) Diagrama de dispersión que muestra la alternancia espontánea en el laberinto en Y por parte de ambos grupos de ratones. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 8/grupo). Campo abierto (OF) (E) La visualización del mapa de calor que muestra ejemplos típicos de comportamiento exploratorio en la prueba de campo abierto en los grupos de ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+. El rojo representa un mayor tiempo invertido y el azul representa un tiempo mínimo invertido durante la prueba. (F) Diagramas de dispersión que muestran el tiempo total pasado en el centro de la caja, la distancia recorrida en campo abierto y la velocidad durante 5 min. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 8/grupo).

El laberinto en Y se puede utilizar para evaluar las capacidades cognitivas motoras y la memoria a corto plazo en ratones. La alternancia espontánea en los tres brazos mide la memoria de trabajo espacial en los ratones. Un alto porcentaje de alternancia se considera una alta proporción de entradas en brazos consecutivos (Fig. S8B). Una alternancia de bajo porcentaje (por ejemplo, mala memoria de trabajo) se considera una mayor proporción de entradas repetidas en el mismo brazo. Un ratón con buena memoria de trabajo recordará los brazos del laberinto que ya ha visitado y explorará el brazo visitado menos recientemente. Esto requiere interacción entre varias regiones diferentes del cerebro, como el hipocampo y la corteza prefrontal36. Aquí, no se observó ninguna diferencia significativa en la distancia recorrida por los ratones C3GnT-/- en comparación con los ratones C3GnT+/+, lo que indica la falta de deficiencias motoras significativas de los animales (Fig. 7C). Sin embargo, los ratones C3GnT-/- mostraron una tendencia a pasar menos tiempo en los tres brazos del laberinto en comparación con los ratones C3GnT+/+, lo que sugiere un ligero empeoramiento de la memoria espacial (Fig. 7D).

El campo abierto es una prueba común para evaluar comportamientos similares a la ansiedad en modelos animales: permite evaluar la exploración de entornos nuevos, la actividad locomotora general y proporciona una evaluación inicial del comportamiento relacionado con la ansiedad en roedores37 (Fig. S8C). Los roedores muestran claras aversiones a los ambientes grandes, abiertos y desconocidos. En la prueba de campo abierto, cuando se exponen a un espacio abierto, los ratones generalmente presentan tigmotaxis, que es la tendencia a permanecer cerca de las paredes del espacio abierto y sólo más tarde explorar su centro38,39. Aquí, no se detectaron diferencias entre los ratones C3GnT-/- y C3GnT+/+ para las tareas de campo abierto, como se muestra en el mapa de calor donde las distancias recorridas por los ratones de ambos genotipos parecían similares (Fig. 7E). Sin embargo, los ratones C3GnT-/- parecieron exhibir un fenotipo más exploratorio como lo indica el aumento de la velocidad y la distancia recorrida en la caja (Fig. 7F). En conjunto, las pruebas de comportamiento sugieren una función del hipocampo comprometida en comparación con los ratones C3GnT+/+.

Los glicanos influyen en una variedad de aspectos del desarrollo tisular y de la fisiopatología y las alteraciones en las vías de glicosilación contribuyen a la aparición y/o progreso de disfunciones cerebrales, desde trastornos del neurodesarrollo hasta trastornos neurodegenerativos23,40. Se ha demostrado que las desregulaciones de las vías de O-glicosilación de tipo mucina en modelos animales provocan una variedad de efectos, desde muerte embrionaria hasta defectos del desarrollo y enfermedades como colitis y cáncer41. Los O-glicanos derivados del núcleo 3 desempeñan un papel importante en las funciones protectoras del moco en el colon proximal, donde se expresan más altamente25. Aquí, investigamos el efecto de una glicosilación alterada de mucina en el intestino sobre la fisiología y el comportamiento del cerebro.

Demostramos que los ratones C3GnT -/- mostraban una disminución de los glicanos fucosilados en las mucinas del colon, lo que concuerda con la falta de 3 glicanos centrales. Análisis anteriores mostraron un aumento en el número total de bacterias en el moco en comparación con las muestras fecales en ratones C3GnT-/- y ratones C1galt1-/- (ratones con deficiencia de núcleo 1)26. Aquí demostramos que la composición filogénica de la microbiota intestinal asociada a heces y moco se mantuvo estable después de 3 semanas, siendo Firmicutes y Bacteroidetes los filos más abundantes, mientras que Deferribacteres/Deferribacterota, Actinobacteria/Actinobacteriota/Actinomycetota y Proteobacteria/Pseudomonadota estuvieron menos representados. Estos resultados son consistentes con la dinámica de la microbiota intestinal en ratones libres de patógenos específicos (SPF), y muestran que en una etapa temprana de la vida (9 días después del destete) y en una etapa tardía (141-150 días después del destete), la materia fecal La microbiota está dominada por Firmicutes y Bacteroidetes con una contribución menor de Actinobacteria, Proteobacteria y Verrucomicrobia/Verrucomicrobiota42. No hubo diferencias claras en la composición de la microbiota intestinal entre los grupos, aparte de un aumento en la abundancia relativa de Lactobacillaceae en ratones C3GnT-/-, que necesitará más confirmación. La mayor permeabilidad intestinal en ratones C3GnT-/- en comparación con ratones C3GnT+/+ puede facilitar el paso de señales/metabolitos de microbios intestinales al cerebro, especialmente aquellos derivados de microbios asociados al moco que están muy cerca de la mucosa subyacente. Aquí, demostramos que el contenido cecal de ratones C3GnT-/- exhibía niveles alterados de metabolitos relacionados con la enfermedad de Alzheimer (EA) y la depresión, como los metabolitos derivados de N-acetil-lisina, acetil-carnitinas, dimetilglicina y acetil-l-tirosina43. 44,45,46.

En el hipocampo, se utilizó PSA-NCAM, expresado en dos tipos de células granulares, células progenitoras intermedias y células granulares inmaduras, como marcador de neuronas en proliferación. Las células granulares no presentan PSA-NCAM cuando maduran y entran al circuito neural superior47,48. Aquí, las células granulares inmaduras PSA-NCAM+ en el nicho neurogénico del cerebro en los ratones C3GnT-/- mostraron un fenotipo atípico con dendritas cortas y desorganizadas que parten del soma celular y una relación alterada entre progenitores neurales intermedios/células granulares inmaduras. en comparación con ratones de control donde estas células exhiben un fenotipo completamente desarrollado y una distribución equilibrada de las células granulares en proliferación/diferenciación49. Esta observación fue respaldada por un número reducido de células granulares de PSA-NCAM+ y una disminución en el contenido polisiálico en el cerebro de ratones C3GnT-/- en comparación con los ratones de control. Dado el papel de las células granulares PSA-NCAM+ en la memoria espacial y de discriminación50,51, a continuación evaluamos el patrón de comportamiento relacionado con la memoria y el reconocimiento en compañeros de camada C3GnT. Este análisis reveló una alteración significativa en la capacidad de los ratones C3GnT-/- para discriminar objetos nuevos y familiares en comparación con los ratones C3GnT+/+, lo que sugiere un deterioro de los circuitos de memoria del hipocampo, consistente con la expresión alterada de PSA-NCAM en el DG de ratones C3GnT-/-, aunque también se puede considerar la participación de la corteza prefrontal medial (mPFC), como se informó anteriormente52. Se ha demostrado que el agotamiento de PSA-NCAM del DG reduce el aprendizaje espacial y afecta la memoria a largo plazo de tareas no espaciales en ratones53. Además, el deterioro de las células granulares en el hipocampo está fuertemente relacionado con el mantenimiento de la memoria54, que afecta la tarea de la memoria de reconocimiento en ratas55. En ratones antes del destete, un estudio reciente informó que ratones transgénicos que carecían del gen St6Gal1 que codifica la β-galactósido α-2,6-sialiltransferasa 1, la enzima responsable de catalizar la transferencia de ácido siálico del ácido siálico CMP a los que contienen galactosa. sustratos, mostraron un deterioro de la memoria espacial y de reconocimiento, una regulación negativa de la vía involucrada en la formación de PSA-NCAM así como una alteración en la composición de Firmicutes56, debido a la falta de 2,6-sialilación de los oligosacáridos de la leche. Nuestros datos respaldan aún más la importancia de la glicosilación del huésped en la mediación de la comunicación entre la microbiota intestinal y el cerebro.

Además de la regulación de PSA-NCAM y el cambio en la cognición en ratones C3GnT-/-, observamos una tendencia en la disminución de la concentración cerebral de ZO-1 y ocludina. Se trata de dos proteínas importantes implicadas en la regulación de la barrera hematoencefálica57. Por ejemplo, se observó una expresión reducida de ZO-1 y ocludina, junto con una mayor permeabilidad de la BHE, en células endoteliales cultivadas expuestas al péptido amiloide Aβ1–4258. De manera similar, la expresión de ocludina y ZO-1 disminuyó después de la inducción experimental de embolia cerebral en capilares cerebrales de rata aislados59. Si bien aún se están investigando los mecanismos exactos por los cuales la ocludina y la ZO-1 regulan la BHE, su papel en el mantenimiento de la permeabilidad selectiva de la barrera es evidente. Comprender la desregulación de estas proteínas en ratones C3GnT-/- puede proporcionar información valiosa sobre la patogénesis de diversos trastornos neurológicos que involucran el eje intestino-cerebro y potencialmente conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

En conjunto, nuestros resultados sugieren que una glicosilación de mucina alterada en el colon puede contribuir a una modulación potencial del fenotipo de las células granulares inmaduras que expresan PSA-NCAM. Curiosamente, la suplementación a largo plazo del simbionte intestinal Akkermansia muciniphila en un modelo de ratón con EA temprana dio como resultado una reparación de la disfunción de la barrera intestinal y mejoras en la cognición y las conductas relacionadas con la ansiedad, lo que respalda el papel de una barrera mucosa deteriorada en la alteración. que ocurre en el hipocampo de estos ratones60. Nuestros estudios de comportamiento confirmaron una función deteriorada del hipocampo en los ratones C3GnT-/-, como lo demuestra la disminución en el reconocimiento y la memoria espacial, pero se necesita más trabajo para identificar los metabolitos microbianos que afectan los cambios fisiológicos y funcionales observados en el hipocampo de C3GnT-/. − ratones.

Todos los procedimientos y protocolos experimentales realizados fueron revisados ​​y aprobados por el Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal de la Universidad de East Anglia (UEA AWERB) y se llevaron a cabo de acuerdo con la especificación de la Ley de Procedimientos Científicos Animales del Reino Unido de 1986 (Reglamento de Enmienda de 2012) bajo la licencia de proyecto Home Office PP9417531. Los informes de los resultados del estudio cumplen con las directrices ARRIVE (Investigación con animales: Informes de experimentos in vivo)61.

Primero criamos ratones C57BL/6 con ratones C3GnT-/- para generar ratones heterocigotos para el gen (C3GnT+/-). Una vez que las crías (F1) alcanzaron la madurez sexual (~ 6 a 8 semanas de edad), se criaron machos y hembras C3GnT+/- para generar la colonia de ratones F2. Las camadas F2 estaban compuestas por un 25% de ratones homocigotos de tipo salvaje (C3GnT+/+), un 50% de ratones heterocigotos C3GnT+/- y un 25% de ratones homocigotos knock-out (C3GnT-/-). Después del destete (a las 3 semanas de edad), se genotiparon las camadas de ratones mediante análisis de ADN genómico (ADNg) de biopsias de oreja. Brevemente, se extrajo ADNg de biopsias de oído utilizando la solución de extracción de ADN Quick Extract (Lucigen) siguiendo el consejo del proveedor. La PCR se llevó a cabo utilizando la polimerasa de inicio en caliente GO TAQ (R) (Promega, Reino Unido), y se utilizaron cebadores a una concentración final de 1 µM (Tabla S2). Las condiciones consistieron en un paso inicial de desnaturalización de 2 min a 95 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C durante 45 s, 58 °C durante 45 s, 72 °C durante 45 s y un paso de extensión final de 5 min a 72 °C. C. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% en Tris-Acetato EDTA (TAE) 1 × durante 60 minutos a 80 V en presencia de marcadores de ADN de 100 pb (New England Biolabs, EE. UU.). El ADN se tiñó agregando 1 μl de tinción directa de ADN verde Midori (Geneflow, Reino Unido) a 9 μl de producto de PCR antes de cargarlo en el gel y se tomaron imágenes bajo luz ultravioleta usando un Alphaimager.

Los ratones C3GnT+/+ y C3GnT-/- fueron luego enjaulados individualmente durante 4 semanas (período de aislamiento), para permitir el desarrollo de la microbiota intestinal según el genotipo de los ratones provenientes de las mismas parejas reproductoras (control de camada). Se recolectaron muestras fecales antes del tiempo de aislamiento (~ 21 días después del nacimiento, denominado "Tiempo 1") y después del período de aislamiento (~ 75 días después del nacimiento, denominado "Tiempo 2"). Cuando los ratones alcanzaron entre 9 y 10 semanas de edad, fueron sacrificados aumentando la concentración de CO2 y, después de confirmar la muerte por dislocación del cuello, se recogieron y almacenaron el cerebro, la sangre, el contenido cecal y la mucosidad raspada del colon para análisis posteriores. . También se utilizaron ratones C3GnT+/+ (n = 8) y C3GnT−/− (n = 8) para la batería de pruebas de comportamiento (Fig. S9).

Se extrajo ADN de muestras fecales y se raspó moco colónico utilizando el kit Fast DNA™ SPIN para extracción de ADN del suelo (MP Biomedicals, EE. UU.) con las siguientes modificaciones. El peso de la materia fecal se midió en tubos tarados. Las muestras se resuspendieron en 978 μl de tampón de fosfato de sodio (proporcionado) antes de incubarlas a + 4 °C durante 1 h después de la adición de 122 μl de solución de lisis MT Buffer. Luego, las muestras se transfirieron a los tubos de lisis y se homogeneizaron en un instrumento FastPrep® (MP Biomedicals) 3 veces durante 40 s a una velocidad de 6,0 m/s con un intervalo de 5 minutos en hielo entre cada paso de batido de perlas. Luego se siguió el protocolo recomendado por el proveedor.

Después de la extracción del ADN del sedimento fecal y el moco, Qubit y Nanodrop evaluaron la concentración y la calidad del ADN. El ADN se normalizó a 5 ng/μl y se secuenció internamente. Las regiones del gen V3 y V4 16S rDNA se amplificaron utilizando cebadores universales. Para la primera PCR, cada pocillo contenía 4 µL de tampón kapa2G, 0,4 µL de dNTP, 0,08 µL de polimerasa kapa2G, 0,4 µL de cebador específico de cola directa 10 µM, 0,4 µL de cebador específico de cola inversa 10 µM, 13,72 µL de agua de calidad para PCR y 1 µL de ADN normalizado. . Las condiciones de la PCR fueron 95 °C durante 5 min seguido de 30 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s con un paso final a 72 °C durante 5 min. Luego se realizó un SPRI 0,7 × utilizando KAPA Pure Beads (Roche, Reino Unido) y el ADN se eluyó en 20 μl de EB (Tris-HCl 10 mM).

Después de la primera PCR, se realizó una segunda PCR usando 5 µL del producto de PCR limpio, 4 µL de tampón kapa2G, 0,4 µL de dNTP, 0,08 µL de polimerasa kapa2G, 2 µL de cada cebador P7 y P5 de los cebadores índice Nextera XT Index Kit v2 ( Illumina nº de catálogo FC-131-2001 a 2004) se añadieron a cada pocillo. Finalmente, se agregaron y mezclaron los 5 µL de la mezcla de PCR específica limpia. La PCR se realizó a 95 °C durante 5 min, 10 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s seguido de un paso final a 72 °C durante 5 min. Luego, las bibliotecas obtenidas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo de ADNds Quant-iT, kit de alta sensibilidad (Fisher Scientific, Reino Unido) en un lector de placas FLUOstar Optima. Las bibliotecas se agruparon tras la cuantificación en cantidades iguales. La piscina final se limpió con SPRI 0,7× usando KAPA Pure Beads. El conjunto final se cuantificó en un instrumento Qubit 3.0 y se ejecutó en una ScreenTape D1000 de alta sensibilidad (Agilent) utilizando Agilent Tapestation 4200 para calcular la molaridad del conjunto de biblioteca final.

El conjunto se ejecutó a una concentración final de 8 pM en un instrumento Illumina MiSeq utilizando el kit de reactivos MiSeq® v3 (600 ciclos, Illumina) siguiendo las recomendaciones de carga y desnaturalización de Illumina que incluían un aumento de PhiX del 20 % (PhiX Control v3 Illumina). Los datos sin procesar se analizaron localmente en MiSeq utilizando MiSeq Reporter.

Las lecturas sin procesar producidas por la secuenciación Illumina MiSeq de los amplicones 16S se procesaron con el flujo de trabajo CIT62 de Dadaist2 0.8, utilizando SeqFu 1.9 CIT63 para eliminar los cebadores universales utilizados para amplificar la región objetivo, y luego se procesaron a través de DADA2 1.1664 para identificar las variantes de secuencia de amplicones ( ASV) y generar una tabla de contingencia (con la abundancia bruta de cada ASV en cada muestra). El paquete DECIPHER65 se utilizó para asignar taxonomía a cada ASV identificado utilizando la base de datos SILVA 13866, y los resultados se exportaron a un objeto PhyloSeq CIT67 para su análisis posterior.

Se recogieron tejido colónico y cerebro de ratón y se almacenaron en RNAlater a + 4 ° C hasta la extracción del ARN. Luego se transfirieron las muestras (10 a 100 mg) a un tubo que contenía 1 ml de reactivo de lisis QIAzol (Qiagen, Reino Unido) y perlas de acero inoxidable de 5 mm (Qiagen, Reino Unido). La homogeneización se logró utilizando FastPrep®-24 mediante 2 carreras intermitentes de 60 s a una velocidad de 4,0 m/s con un intervalo de 5 min a temperatura ambiente. La extracción de ARN se realizó utilizando el mini kit RNeasy Lipid Tissue (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante para la purificación del ARN total de tejidos animales. La elución se realizó según lo recomendado con 50 μl de agua libre de ARNasa. La calidad y concentración de las muestras de ARN se evaluaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 2000, el ensayo Qubit RNA HS en el fluorómetro Qubit® 2.0 (Life Technologies, Reino Unido) o el kit Agilent RNA 600 Nano en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Stockport, Reino Unido). . Después de la extracción de ARN, la síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando la transcriptasa inversa QuantiTect (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, incluidos los controles que carecían de transcriptasa para analizar la contaminación del ADN (control -RT).

Para la transcripción inversa cuantitativa, las reacciones de PCR (RT-qPCR) se realizaron utilizando la tecnología de detección verde SYBR en el ciclador de luz Roche 480 (Roche Life Science, Reino Unido). Las muestras se cargaron en 384 placas de microtitulación de forma aleatoria y los cebadores también se aleatorizaron por triplicado. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla S3.

Se raspó la mucosidad del colon y se resuspendió en PBS frío y se mantuvo en hielo. Luego, la solución se centrifugó a 1000 xg durante 30 minutos para separar las bacterias (gránulo) y las proteínas solubles (sobrenadante). El sedimento de bacterias se almacenó a -80 °C hasta la extracción del ADN. La presencia de Muc2 en la fracción soluble se confirmó mediante transferencia de ranura, utilizando un anticuerpo anti-MUC2, después de bloquear la membrana de PVDF con tampón de bloqueo sin proteínas (PBS) Pierce™ (ThermoFisher). El sobrenadante de muestras de 15 C3GnT+/+ y 12 C3GnT-/- se agruparon según el genotipo y se procesaron para la extracción y purificación de mucina. Brevemente, se añadió cloruro de cesio a las muestras a una densidad final de 1,4 g/ml y las muestras se ultracentrifugaron a 42.000 rpm en un rotor Beckman Coulter 70 Ti. Se recogieron fracciones (1 ml cada una) y aquellas con una densidad superior a 1,4 g/ml se reunieron, se dializaron frente a agua y se liofilizaron. Las mucinas purificadas se sometieron a β-eliminación en condiciones reductoras (NaOH 0,1 M, borohidruro de sodio 1 M, NaBH4) durante 20 h a 45 °C. La reacción se detuvo añadiendo lentamente 5 gotas de ácido acético glacial (Sigma). Se montó una columna de desalación empacando una pipeta Paster, con lana de vidrio para controlar el flujo (Sigma) y perlas en forma de hidrógeno Dowex 50 W × 8 (Sigma). Después de la elución de la columna de desalinización con 15 ml de ácido acético glacial, las muestras se cargaron en la columna. Las fracciones recogidas se secaron bajo una corriente de nitrógeno para evaporar el exceso de boratos.

La permetilación se realizó en O-glicanos liberados de muestras de mucina. Las muestras se solubilizaron en 200 µl de dimetilsulfóxido (DMSO). Luego se agregaron NaOH (1 sedimento) y 300 µL de yodometano a la suspensión en condiciones anhidras y las muestras se agitaron vigorosamente a temperatura ambiente durante 90 minutos. La reacción de permetilación se detuvo mediante la adición de 1 ml de ácido acético (5% vol/vol). Los O-glicanos permetilados se extrajeron en 1 a 2 ml de cloroformo y 5 ml de agua ultrapura, se mezclaron completamente mediante vórtex y se centrifugaron a 14.000 xg durante 2 minutos para permitir que la mezcla se endureciera en dos capas. La parte acuosa superior (que contenía DMSO) se eliminó y se descartó. La capa inferior de cloroformo se lavó cinco veces con agua MilliQ (1 ml) y luego se secó bajo nitrógeno usando una unidad de evaporación. Las muestras secas se disolvieron en acetonitrilo al 30 % en ácido trifluoroacético acuoso al 0,1 % (TFA, Sigma) y se mezclaron 1:1 con 20 mg/ml de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHBA) en el mismo disolvente. Se colocaron 2 μl en una placa objetivo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) para su análisis.

Los datos MALDI-TOF (tiempo de vuelo en tándem) y TOF/TOF-MS se adquirieron utilizando el espectrómetro de masas analizador Bruker Autoflex (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) en modo de iones positivos y reflectrón. La cuantificación relativa de la sialilación en mucinas se calculó basándose en la suma de todas las áreas de picos de masa correspondientes a estructuras sialiladas dividida por la suma de todas las áreas de picos de masa correspondientes a O-glicanos definidos. Se realizaron cálculos similares para determinar la cuantificación relativa de la fucosilación o sulfatación de mucinas. La identificación de estructuras de glucanos se realizó utilizando el software Glycoworkbench68.

Para evaluar la permeabilidad intestinal, los ratones C3GnT+/+ y C3GnT-/- se mantuvieron en ayunas durante 4 h antes de la administración de 150 μl de isotiocianato de fluoresceína dextrano (FITC) (80 mg/ml 4 kD; Sigma-Aldrich) en PBS 1x estéril por vía oral. sonda. Los ratones se sacrificaron siguiendo el programa 1 aumentando la concentración de CO2 4 h después del tratamiento con FITC, y se recogió sangre mediante punción intracardial. Las muestras de sangre se diluyeron 1:4 en PBS y la concentración de FITC-dextrano se determinó utilizando un fluorímetro (FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH) con una longitud de onda de excitación de 490 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm. Se utilizó FITC-dextrano diluido en serie para generar una curva estándar (de 8000 a 0,125 ng/ml) (Fig. S3).

El contenido cecal (100–200 mg) de ratones C3GnT+/+ (n = 6) y C3GnT−/− (n = 6), el cerebro (100–200 mg) de C3GnT+/+ (n = 9) y C3GnT− /- (n = 9) ratones y el suero (50–60 µL) agrupado de ratones C3GnT+/+ (n = 5) y C3GnT-/- (n = 5) fueron procesados ​​y analizados por Metabolon, Inc, EE. UU. Se detectaron un total de 705 metabolitos en el cerebro, 911 en el contenido cecal y 945 en el suero. Los metabolitos se identificaron comparándolos con entradas de biblioteca de estándares purificados o entidades desconocidas recurrentes. Metabolon mantiene una biblioteca basada en estándares autenticados que contiene el tiempo/índice de retención (RI), la relación masa-carga (m/z) y datos cromatográficos (incluidos los datos espectrales de MS/MS) de todas las moléculas presentes en la biblioteca. Además, las identificaciones bioquímicas se basan en tres criterios: índice de retención dentro de una ventana RI estrecha de la identificación propuesta, coincidencia de masa precisa con la biblioteca ± 10 ppm y puntuaciones directas e inversas de MS/MS entre los datos experimentales y los estándares auténticos. Las puntuaciones de MS/MS se basan en una comparación de los iones presentes en el espectro experimental con los iones presentes en el espectro de la biblioteca.

Después del lavado transcardial con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS, se extrajeron los cerebros de ratón y se mantuvieron durante la noche en PFA a + 4 °C. A continuación, los cerebros se lavaron en PBS y se deshidrataron mediante incubación en una serie ascendente de alcohol, comenzando desde 30–50–70–90 hasta 100% de etanol durante 1 h cada uno, seguido de hidratación en concentraciones decrecientes de etanol, desde 100 hasta el 100%. 30% y utilizando PBS en el paso final. Luego, los cerebros se incluyeron en agar al 3% con los bulbos hacia arriba y se cortaron rodajas de 60 µm usando un vibratomo (Leica, VT1200S). Luego, las secciones de cerebro flotantes se transfirieron a una placa de múltiples pocillos (Corning, Reino Unido) con un pincel. Para la inmunohistoquímica, se seleccionaron secciones flotantes libres según la región de interés, siguiendo un atlas de cerebro de ratón (Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact 5th Edition).

Primero se incubaron secciones de cerebro (coordenadas Bregma de -1,22 a -2,46 mm, incluidos el hipocampo y el hipotálamo) con tampón desenmascarador de antígeno (tampón citrato 10 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 6,0) precalentado a 70 °C durante 15 minutos a 70 °C en baño maría. Luego, las secciones se bloquearon durante 2 h con una solución de PBS que contenía 20 % de suero de cabra normal (NGS, Gibco) y 1 % de Triton X100 y luego se incubaron durante la noche a + 4 °C con anticuerpos primarios (Tabla S4) en una solución que contenía 0,2 %. NGS y 0,1% Tritón X100. Luego, las secciones se lavaron cinco veces mediante incubación de 1 h cada una a temperatura ambiente en NGS al 0,2 % y Triton X100 al 0,1 % y luego se incubaron durante la noche a + 4 °C con los anticuerpos secundarios relevantes diluidos en el tampón utilizado para los anticuerpos primarios (Tabla S4). Después del lavado en PBS (6 veces, 30 min de incubación cada una), las secciones se tiñeron con 4',6-diamidin-2-fenilindolo DAPI (1 µg/mL, Thermo Fisher, Reino Unido) durante 5 min, se lavaron, se montaron y se cubrieron. deslizado con medio de montaje (VECTASHIELD Antifade Mounting Medium-H100).

Los cerebros recién extraídos de compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT-/- se separaron en los dos hemisferios para obtener secciones sagitales y se almacenaron a -80 °C hasta su uso; Para la lisis del tejido, se extirpó la zona expuesta del hipocampo con una cuchilla del hemisferio derecho e izquierdo, resultando en el hipocampo y las regiones circundantes. Los extractos de tejido (15–20 mg) se homogeneizaron en 500 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, aprotinina 70 µg/ml, 10 µg/ml). leupeptina, 2% Triton X-100) como se describe69. Los lisados ​​se trataron con 25 ng/μl de endosialidasa durante 45 minutos en hielo. Luego, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 4–12 % (50 µg de proteína total por carril), seguido de transferencia Western durante 16 h a 4 °C. Las membranas se incubaron con 0,4 µg/ml de anticuerpo monoclonal de rata (mAb) H28 específico de NCAM y 1 µg/ml de mAb 735 de ratón específico de poliSia (IgG2a) (amablemente proporcionado por el profesor Herbert Hildebrandt). Para identificar proteínas de unión estrecha, se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo (PAB) específicos de ZO-1 1:1000 (Thermo Fischer Scientific) y mAb de ratón específico de Occludina 1:1000 (Thermo Fischer Scientific). Se utilizó GAPDH como control de carga utilizando PAB específicos de GAPDH (Abcam). Los anticuerpos unidos se detectaron con IgG anti-ratón o anti-conejo acoplada a peroxidasa (Vector Laboratories) y se desarrollaron mediante quimioluminiscencia mejorada utilizando el sustrato Clarity Western ECL (BioRad). La cuantificación se realizó utilizando el software ImageLab (Bio-Rad).

El reconocimiento de objetos novedosos (NOR), una medida de la memoria de reconocimiento, se realizó como se describió anteriormente70,71 con ligeras modificaciones. Brevemente, el día 1, los ratones (n = 8/grupo) se habituaron a un aparato gris de 50 × 50 × 50 cm iluminado con iluminación de bajo lux (100 lx), colocándolos en el laberinto vacío y permitiéndoles moverse libremente durante 10 minutos. Min luego regresó a la jaula. El día 2, los ratones fueron colocados nuevamente en el laberinto y condicionados a un solo objeto durante un período de 10 minutos. El día 3, los ratones fueron colocados en la misma área experimental en presencia de dos objetos idénticos durante 15 minutos, después de lo cual fueron devueltos a sus respectivas jaulas y se observó un intervalo entre ensayos de 1 h. Uno de los objetos familiares fue reemplazado por un objeto novedoso. Los ratones se colocaron nuevamente dentro del área de prueba durante los últimos 10 minutos. Los videos se analizaron durante un período de 5 minutos, después del cual, si no se lograba alcanzar un total acumulado de 8 s en presencia de ambos objetos (familiares y nuevos), el análisis continuó durante los 10 minutos completos o hasta que el ratón completara 8 s. s de tiempo pasado cerca del objeto. Los ratones que no alcanzaron el tiempo requerido fueron excluidos del análisis72. Se calculó un índice de discriminación (DI) de la siguiente manera: DI = (TN − TF)/(TN + TF), donde TN es el tiempo dedicado a explorar el objeto nuevo y TF es el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar.

La prueba de alternancia espontánea del laberinto en Y, una medida de la memoria de trabajo espacial, se realizó el último día de la prueba de comportamiento, como se describió anteriormente73. Brevemente, el aparato del laberinto en Y hecho de plexiglás blanco de tres brazos distintos (dimensiones 38,5 × 8 × 13 cm, cada brazo en un ángulo de 120° entre sí) se iluminó con iluminación de bajo lux (100 lx). El ratón a probar se colocó en el laberinto y se le permitió explorar libremente durante 7 minutos mientras el software de seguimiento registraba la transición de zona y la actividad locomotora (Ethovision XT, Noldus, Reino Unido). Se espera que el ratón, siguiendo su instinto natural de exploración, recorra el laberinto y visite cada brazo por igual.

La prueba de campo abierto (OFT) se realizó como se describió anteriormente74. Brevemente, el ratón a probar se colocó en el centro del OFT y un sistema de seguimiento por video (Ethovision XT, Noldus, Reino Unido) registró la distancia total que recorrieron los ratones, así como el tiempo que pasaron en el centro del campo. dentro de los primeros 5 min. El laberinto de campo abierto se limpió entre cada ratón con etanol al 20% para eliminar los olores. Se espera que el ratón explore la caja, manteniéndose cerca de las paredes (tigmotaxis)42.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la versión R 4.1.0. En el análisis de glucanos de mucinas intestinales, se realizaron al menos tres réplicas técnicas para cada fracción y se utilizaron pruebas t para comparar las realizadas para cada fracción entre los compañeros de camada C3GnT+/+ y C3GnT-/-.

En el análisis de la microbiota intestinal, los datos 16S se filtraron de modo que solo se incluyeran ASV con un recuento superior a 3 en al menos el 20 % de las muestras. Luego, los ASV se agregaron en familias para el análisis primario. Las abundancias relativas y las proporciones logarítmicas centradas de cada familia se representaron gráficamente por genotipo con medias e intervalos de confianza.

La matriz de distancias de Bray-Curtis se calculó con base en la suma total de datos escalados y la ordenación de escala multidimensional (MDS) se trazó en los estratos correspondientes al punto de muestra (Tiempo 1 frente a Tiempo 2). PERMANOVA se realizó utilizando adonis2 del paquete vegan R. Para el análisis de abundancia diferencial, se utilizaron dos enfoques. Primero, se aplicó DESeq2 a los datos de recuento (agregados a nivel familiar) por separado para las muestras fecales (Tiempo 2) y se raspó el moco de forma independiente para comparar los recuentos familiares entre genotipos. Se aceptaron todos los valores predeterminados de DESeq2, incluida la corrección de Benjamini-Hochberg a los valores p.

En segundo lugar, se aplicaron modelos de regresión lineal estándar a las proporciones logarítmicas centradas calculadas utilizando el paquete de microbioma en R. Los análisis también se repitieron en otros tres conjuntos de datos: (1) todos los ASV, (2) los 20 ASV principales solo agregados en familias, (3) datos agregados al nivel de Phylum.

Las diferencias en la expresión genética entre grupos se calcularon estimando el efecto del genotipo en los valores de Ct, ajustando los valores de Ct de ambos genes constitutivos (Gapdh y Tbp), con un ratón individual incluido como efecto aleatorio y replicado como efecto fijo. Los datos de tres muestras se eliminaron antes del análisis, como valores atípicos basados ​​en la inspección visual de los valores de Ct. Los datos se presentan como una proporción estimada de expresión génica (C3GnT-/- frente a C3GnT+/+) con intervalos de confianza del 95% para cada gen. Los valores de P se ajustaron utilizando el método de Benjamini-Hochberg teniendo en cuenta catorce genes que se probaron simultáneamente.

Se calculó una estimación de la tasa de descubrimiento falso (valor q) para tener en cuenta las múltiples comparaciones que normalmente ocurren en estudios basados ​​en metabolómica. El valor q describe la tasa de descubrimiento falso; un valor q bajo (q < 0,10) es una indicación de alta confianza en un resultado.

En el estudio de comportamiento, los datos se analizaron utilizando el software “Origin 9” (OriginLab, Northampton, EE. UU.). Para la evaluación de pruebas de comportamiento en ratones se utilizó la prueba t no apareada con comprobaciones de normalidad de los gráficos QQ. Los valores atípicos se detectaron mediante la prueba ROUT o Grubbs.

Los autores confirman que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus materiales complementarios. Las lecturas sin procesar producidas para el análisis de metacódigos de barras de este proyecto están disponibles en EBI ENA, con el ID de acceso del proyecto PRJEB57587 y el ID de estudio ERP142578. Los datos de metabolómica estarán disponibles previa solicitud para el autor correspondiente.

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Los autores agradecen el apoyo del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC); Esta investigación fue financiada por la Subvención del Programa Estratégico del Instituto BBSRC Microbios Intestinales y Salud BB/R012490/1 y sus proyectos constituyentes BBS/E/F/000PR10353 (Tema 1, Determinantes de las respuestas del microbio-huésped en el intestino a lo largo de la vida) y la CE llevó a cabo una beca de formación doctoral del BBSRC Norwich Research Park BB/M011216/1. GS y AT recibieron el apoyo de la subvención de capacidad básica BB/CCG1860/1 del BBSRC. Los autores agradecen a Mohammad K. Hajihosseini por el acceso al vibratomo y a Herbert Hildebrandt por los anticuerpos y reactivos para detectar PSA-NCAM mediante análisis de transferencia Western. Los análisis bioinformáticos se han realizado utilizando la capacidad informática proporcionada por la subvención MRC CLIMB BIG DATA MR/T030062/1.

Programa estratégico del Instituto de Microbios Intestinales y Salud, Quadram Institute Bioscience, Norwich, NR4 7UQ, Reino Unido

Erika Coletto, George M. Savva, Dimitrios Latousakis, Emmanuelle H. Crost, Laura Vaux, Andrea Telatin y Nathalie Judge

Facultad de Medicina de Norwich, Centro de Investigación Biomédica, Universidad de East Anglia, Parque de Investigación de Norwich, Norwich, NR4 7TJ, Reino Unido

Mateo Pontifex y David Vauzour

Departamento de Biología, Universidad de Columbia Británica, Campus Okanagan, 3333 University Way, Kelowna, BC, V1V 1V7, Canadá

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NJ supervisó el trabajo y coordinó la redacción del manuscrito. EC realizó la mayoría de los experimentos con ratones y análisis posteriores. DL llevó a cabo análisis de glicosilación de mucina. AT analizó los datos de secuenciación del ADNr 16S sin procesar. GMS realizó análisis bioinformáticos y estadísticos. MP y DV llevaron a cabo pruebas y análisis del comportamiento de ratones. LV y EHC ayudaron con experimentos con ratones, recolección y procesamiento de muestras. KB generó el modelo de ratón y revisó el manuscrito. NJ y EC escribieron y revisaron el manuscrito con la contribución de GMS, DL, MP y DV.

Correspondencia a Nathalie Juge.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Coletto, E., Savva, GM, Latousakis, D. et al. Papel de la glicosilación de mucina en el eje microbiota intestinal-cerebro de ratones con deficiencia de O-glicano central 3. Informe científico 13, 13982 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40497-8

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Recibido: 03 de marzo de 2023

Aceptado: 11 de agosto de 2023

Publicado: 26 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40497-8

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